本發明專利技術提供胎兒非整倍體性無創產前診斷的方法和組合物。識別了多種差異甲基化區域(DMR)。某些所述的DMR在成人女性血液DNA中低甲基化，在胎兒DNA中高甲基化；而其它的在成年女性血液DNA高甲基化，在胎兒DNA低甲基化。此外，在成人女性血液DNA中低甲基化并且在胎兒DNA中高甲基化的DMR，已經表明，以精確預測存在于妊娠期母體血液樣品中胎兒DNA的非整倍體性。在本發明專利技術的方法中，高甲基化DNA優選通過甲基化DNA免疫沉淀從低甲基化DNA中物理分離。
【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】無創產前診斷胎兒非整倍體性的方法和組合物
技術介紹
產前診斷目前一般使用傳統細胞遺傳學分析(例如核型)或者DNA分析(例如QF-PCR),其要求通過羊膜穿刺術,絨毛膜絨毛樣檢或者脊索穿刺(chordocentesis)獲得胎兒遺傳材料。盡管如此，這些是創傷性治療程序，并且具有顯著的胎兒死亡風險(絨毛膜絨毛樣檢和羊膜穿刺術為O. 5至1% ) (Hulten, Μ. A.等(2003)Reproduction 126 279-297)。有效產前診斷測試的必要性尤其重要，就唐氏綜合癥(也稱為三染色體21綜合癥)來說，其是產生智力遲鈍頻率最高的形式(具有在世界范圍所有出生嬰兒中700分之一的發生率)。盡管如此，由于目前的產前測試的風險，產前診斷只提供給高風險的妊娠(所有妊娠中的6-8%)，其評價是根據母體血清篩選和胎兒和胎兒超聲波檢查方法。因此，迫切需要發展不會對胎兒造成危險的診斷方法，也通常被稱為無創產前診斷。在懷孕期間的母體循環中發現了游離胎兒DNA (ffDNA) (Lo, Y. M.等(1997)Lancet^迎485-487)，其已經成為發展無創產前測試的重要替代途徑。ffDNA已經被成功 用于確定胎兒性別和在母體血漿中的胎兒RhD狀態(Lo，Y. Μ.等(1998) N. Engl. J. Med. 339 1734-1738 ；Bianchi,D. ff.等(2005)Obstet. Gynecol. 106 :841-844)。盡管如此，對存在于過量母體DNA中的限定量的ffDNA (3至6 % )進行直接分析，其對發展胎兒非整倍體性的無創性測試是巨大挑戰。在所述領域的最新進展顯示所述ffDNA的物理和分子特性可以用于將其從循環母體DNA中鑒別出來或者作為胎兒DNA富集的手段(Chan，K. C.等(2004)Clin. Chem. 50j88-92 ；Poon, L. L.等(2002) Clin. Chem.堅35-41)。例如，按大小進行分離的方法已經被用于血漿DNA，以富集胎兒DNA，因為胎兒DNA通常比循環中母體DNA的短(Chan，K. C.等(2004)，supra)。此外，根據母體血漿中ffDNA是來自胎盤起源的證據，母體周圍(整體)血液和胎盤DNA之間的表觀遺傳差異已經被用于檢測在來自胎兒的母體血漿中的低甲基化基因序歹Ij (maspin/SERPINB5) (Masuzaki，H.等(2004) J. Med. Genet. 41 :289-292 ；Fiori,E.等(2004) Hum. Reprod. 19 :723-724 ；Chim, S. S.等(2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA102 14753-14758)。后來，描述了少量的其它差異胎兒表觀遺傳分子標記，包括染色體3上的RASSF1A基因和染色體 21 上的標記(Chiu,R. W.等(2007) Am. T. Pathol. 170 :941-950 ；01d,R. W.等(2007) R印rod. Biomed. Online 15 :227-235 ；Chim, S. S.等(2008) Clin. Chem. M :500-511)。盡管這些研究已經證明在胎兒DNA(從絨毛膜絨毛樣檢獲得的胎盤DNA)和母體外周血DNA之間的表觀遺傳差異，可以作為無創產前診斷潛在的胎兒分子標記，并且目前為止僅僅限定量的基因組區域已經被識別或檢測出來。大量的研究集中于單基因啟動子區域(Chim, S. S.等(2005) supra ；Chiu, R. W.等(2007, supra),然而其它的已經研究了在染色體 21 上的 CpG 島(Old, R. W.等(2007) supra ；Chim, S. S.等(2008) supra)，盡管其僅僅覆蓋一小部分的所述染色體(Fazzari, M. J.等(2004) Nat. Rev. Genet. 5 :446-455) 目前的方法發展了使用ffDNA進行無創產前診斷，常遭受大量的限制。被研究的一種方法涉及利用甲基化敏感限制酶來消除低甲基化母體DNA從而允許ffDNA的直接聚合酶鏈反應(PCR)分析(Old，R.W.等(2007)，supra)。盡管如此，差異甲基化DNA的必要區域(含有甲基化敏感限制酶識別的限制性微點)限制了適合測試的區域的數量。被研究的另一種方法涉及利用亞硫酸氫鈉轉換以允許區別在母體和胎兒DNA之間的差異甲基化。在這種方法中，亞硫酸氫鈉轉換之后進行甲基化特異性PCR或者甲基化敏感單核苷酸引物延伸和 / 或亞硫酸氫鈉測序(Chim, S. S.等(2005) supra ；Chiu, R. W.等(2007) supra ；Chim,S.S.等(2008)SUpra)。這種方法，盡管有兩個主要問題。首先，亞硫酸氫鹽轉換之后的甲基化狀態的精確分析取決于非甲基化胞嘧啶到脲嘧啶的完全轉換(這個條件很少能達到)。其次，在從亞硫酸氫鹽處理后獲得的DNA的降解(描述參見于Grunau，C.等(2001)Nucl.Acids Res. 29 E65-5)變得復雜，甚至進一步的極低量的胎兒DNA的測試和定量。另一種最近的方法已經直接測序細胞游離DNA(cell-free DNA)(來自于懷孕婦女的血衆中)，使用高通量鳥槍測序技術(Fan, H. C.等(2008) Proc. Natl. Acas. Sci. USA105 16266-71 ；Chiu, R. W.等(2008) Proc. Natl. Acad. Sci USA. 105 :20458-63)。但是，這種方法要求技術，并且這種方法的成本高使得它的應用對多數實驗室診斷來說相當困難。·因此，需要其它的途徑和方法，作為無創產前診斷胎兒非整倍體性，以減少胎兒死亡的風險并允許篩選所有的妊娠，而不僅限于高風險妊娠。專利技術概述本專利技術提供一種新的途徑，其根據檢測ffDNA進行無創產前診斷。已經識別在每種被檢測染色體上(染色體13、18、21、X和Y)的大量(多于2000)差異甲基化區域(DMR)(其在母體外周血和胎兒DNA(胎盤DNA)之間被差異甲基化)，通過利用具有高分辨率tiling寡核苷酸陣列(tilingoligonucleotide array)分析的系統稱合甲基化DNA免疫沉淀(MeDiP)，其能夠以高通量的途徑全染色體范圍地識別DNA甲基化模式。進一步的，這些DMR的子集的代表性實施例(其在胎兒DNA中高甲基化，在母體外周血中低甲基化)已經被用來精確預測三染色體21，這種預測方法是基于從在母體血液樣品中的低甲基化DNA物理分離高甲基化DNA (其通常在胎齡的早期妊娠階段，并且沒有對高甲基化DNA或低甲基化DNA進行化學改變或者酶消化)，然后測定在所述高甲基化DNA樣品中的多個DMR的水平。因此，已經證明了本公開的DMR和診斷胎兒非整倍體性的方法的有效性。因此，在一個方面中，本專利技術涉及使用母體血液樣品進行產前診斷胎兒非整倍體性的方法，所述方法包括 a)在母體血液樣品中，從低甲基化DNA中物理分離高甲基化DNA，而沒有使所述低甲基化DNA或高甲基化DNA進本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...
【專利技術屬性】
技術研發人員：P·C·帕特薩里斯，E·A·帕帕喬治烏，
申請(專利權)人：NIPD遺傳學有限公司，
類型：
國別省市：
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