本發明專利技術涉及一種中等長度基因編碼序列單核苷酸多態性(cSNP)快速檢測試劑盒，屬于生物技術領域。具有操作簡單、檢測速度快、成本低廉的特點。本發明專利技術通過簡化非變性聚丙烯酰胺凝膠的制膠、跑膠和染膠的過程，組合優化檢測試劑，在保證cSNP判型質量的前提下達到了快速、高效檢測的效果：制膠只需20分鐘、跑膠只需4-6個小時、染膠和顯色只需30分鐘。省時省力，特別適用于檢測大批量動物組織樣本的中等長度基因的cSNP。本發明專利技術所得到的非變性聚丙烯酰胺凝膠圖條帶清晰，用肉眼即可觀察判型，且結果可靠。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種中等長度基因(150-350 bp)編碼序列單核苷酸多態性(cSNP)的快速檢測試劑盒，屬于生物
技術介紹
單核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)是人類和其它動物基因組中DNA序列上群體發生概率大于1%的單個核苷酸差異。又被稱為第三代DNA遺傳標記。SNP指在染色體基因組水平上單個核苷酸位置存在轉換(C/T互換，在其互補鏈為G/A互換)、顛換(包括C/A、G/T、C/G和A/T)、插入和缺失等變異引起的序列多態性。SNP在人類基因組內廣泛存在，平均每500 1000個堿基對中就有一個。基因組內的任何堿基都存在發生變異的可能，根據SNP所處位置，將SNP劃分為三種形式第一種是分布在基因編碼序列上的單堿基變異(coding sequence SNP, cSNP);第二種是分布在基因內含子上的單核苷酸突變(intixm SNP, iSNP);第三種是分布在基因外部調控區序列上的SNP (regulatory region SNP, rSNP);第四種是分布在其他區域的SNP。基因內部序列包含編碼序列(外顯子)和非編碼序列(內含子)，編碼序列的堿基突變率僅占全部突變的20%，因此位于編碼區內的SNP (cSNP)通常較少。但cSNP在遺傳疾病研究中具有重要意義，根據其對蛋白質二級結構影響來說，cSNP可分為以下兩種 第一種是同義突變(synonymous mutation),即cSNP并不影響基因編碼蛋白質的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的翻譯相同。第二種是錯意突變(missense mutation),即cSNP導致其翻譯的氨基酸發生改變，從而改變其編碼蛋白的序列，影響蛋白質功能。錯意突變cSNP是導致生物性狀改變的關鍵因素。與第一代遺傳標記RFLP和第二代遺傳標記微衛星相比，第三代遺傳標記SNP具有以下優點二等位性、穩定性高、密度高、作用直接和易于進行自動化分析。SNP分析技術按其研究對象主要分為兩大類一是對未知SNP進行分析，即找尋未知的SNP，可用于增加遺傳圖譜精密度，尋找某一性狀的的基因標記。二是對已知SNP進行分析，即對不同群體SNP進行遺傳多樣性檢測，或在臨床上對已知致病基因的遺傳病進行基因診斷。SNP分析最基本的方法是直接測序法、凝膠電泳法和高通量分析法。直接測序法的優點是方便，且信息豐富；缺點是費用很高，時間較長。凝膠電泳法主要有單鏈構象多態性(single strandconformationalpolymorphism, SSCP)、限制性片段長度多態性(restriction fragmentlength polymorphism,RFLP)等,優點是成本低廉、結果可靠,所以科研院所中應用普遍；缺點是對未知的SNP基因型判定時，需結合測序結果確定。高通量SNP分型技術包括基因芯片法(Gene chip)、熒光檢測法(Taqman)、質譜法(Mass spectrum)和高效液相層析法(high performance liquid chromatographyv,HPLC)等，這些方法優點是可大規模、快速檢出SNP，缺點是價格昂貴，且對樣品要求較高。目前實驗室中應用最廣的檢測cSNP的技術為SSCP方法，但原有的操作步驟繁瑣，花費時間較長，如果檢測較多樣品時，會耗費大量的人力物力。SSCP主要分為制膠、跑膠和染膠三步操作步驟如下 第一步為制膠(非變性聚丙烯酰胺凝膠工作液制作)，操作步驟如下(I)蒸餾水清洗玻璃板，室溫自然晾干，夾緊玻璃板和膠條，避免膠條有縫隙而漏膠。(2)配制非變性聚丙烯酰胺凝膠工作液，混合均勻后迅速灌膠。第二步為跑膠(電泳)，操作步驟如下(I)電泳槽中加滿IXTBE電泳液,夾上制好的膠板，預電泳。(2)將上樣液(PCR產物和變性Buffer混合物)一定溫度下變性10min，迅速冰浴8 min。(3) 110 V電壓，電泳10-15 h。 第三步為染膠(非變性聚丙烯酰胺凝膠中DNA的銀染)，操作步驟如下(I)電泳完畢后，取下凝膠，并在凝膠上做標記以區分。(2)將凝膠放入一定濃度的乙醇中固定半小時。(3)棄固定液，蒸餾水漂洗2次，棄漂洗液。(4)加入現配染色液，染色40分鐘。(5)棄染色液，蒸餾水漂洗3次，棄漂洗液。(6)加入現配顯色液，顯色至觀察到清晰條帶。(7)棄顯色液，蒸餾水漂洗2次，將膠裝入保鮮袋中拍照、保存。
技術實現思路
技術問題 本專利技術所要解決的技術問題是提供一種“傻瓜式”的基因編碼序列單核苷酸多態性(cSNP)的快速檢測方法，操作簡單、所用試劑安全、成本經濟、結果可靠，以適應大批量樣品基因cSNP的快速檢測。技術方案 為解決上述技術問題，本專利技術對SSCP的制膠、跑膠(電泳)和染膠三個階段進行了全面改進，節約出大量人力和試劑，并且在不降低實驗效果的前提下減少試劑種類，制作成cSNP快速檢測試劑盒。本專利技術的技術解決方案是 一種中等長度基因編碼序列單核苷酸多態性(cSNP)快速檢測試劑盒，包括30%丙烯酰胺和10 X TBE和50%甘油的10:3:3混合液(溶液A)、10%過硫酸銨(溶液B)、TEMED (溶液C)、變性Buffer (溶液D)和質量比為O. 1%的硝酸銀(溶液E)。上述試劑盒用于檢測中等長度基因編碼序列單核苷酸多態性(cSNP)快速檢測方法為 制膠檢測24個樣品時，需配制一塊含24個點樣孔的非變性聚丙烯酰胺凝膠(膠濃度為10%)，需24次的試劑盒用量，配方為A溶液16.0 ml、B溶液210 yl、C溶液20 μ I、去離子水14. O ml。上述為配制一塊膠的量，配制多塊膠時，按此比例成倍添加試劑即可。灌膠至玻璃板上，室溫放置20分鐘，待凝膠聚合后，小心拔出24齒梳子(拔出后，會產生24個點樣孔)，把此膠板夾到垂直電泳槽上。跑膠向每個樣品的PCR產物(4 μ I)中分別加入D溶液6 μ 1，然后對此溶液混合物(上樣液)，98 °C變性10分鐘，迅速冰浴8分鐘。對上樣液進行點樣，之后預電泳5分鐘，再在4 ° C冰柜內用200 V電壓，電泳4-6小時。染膠(1)先向搪瓷盤中倒入E溶液I ml，再倒入蒸餾水199 ml (即將E溶液稀釋200倍)，搖勻，將膠放入搪瓷盤中，80 rpm搖15分鐘(染膠)，再用蒸餾水快速洗膠約5秒鐘。(2)然后直接用2%的氫氧化鈉于搪瓷盤中沖洗膠5秒鐘(需快速晃動搪瓷盤)，再加入新鮮的2%的氫氧化鈉顯色15分鐘左右，用蒸餾水終止顯色。有益效果 (I)本專利技術優化了制膠環節，用一種溶液(溶液A)代替了三種溶液，減少了操作步驟，降低了實驗誤差，將原來的制膠時間I小時縮短至現在的30分鐘，節約了 50%的時間。(2)同時優化了跑膠(電泳)環境，將原來的電泳時間12-16小時縮短至現在的4-6小時，節約了 60%的時間。(3)在最后的染膠階段，本專利技術將原來的7個操作步驟精減至2個，大大降低了勞動強度，將原來的染膠時間2-3小時縮短至現在的O. 5-1小時，節約了 70%的時間。這些使得本試劑盒成本低廉，操作簡單、省時省力、結果可靠市場競爭力強。本專利技術方法得到的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，條帶清晰，易于觀察(可直接用肉眼觀察)。本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種中等長度基因編碼序列單核苷酸多態性快速檢測試劑盒，包括：溶液A：質量比30%的丙烯酰胺、10×TBE和質量比50%的甘油以體積比10:3:3的混合液；溶液B：質量比10%的過硫酸銨；溶液C：TEMED；溶液D：變性Buffer？；和溶液E：質量比為0.1%的硝酸銀。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：付言峰，任守文，李蘭，李碧俠，王學敏，方曉敏，陳哲，趙芳，涂楓，
申請(專利權)人：江蘇省農業科學院，
類型：發明
國別省市：
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