本發明專利技術公開了一種三七快速鑒定方法，其包括如下步驟：1）以待測樣品DNA為模板，擴增含有SEQ?ID?No.1所示序列的片段；2）對擴增產物進行測序，分析SEQ?ID?No.1所示的序列，如果自SEQ?ID?No.1所示序列的5’端起第140位為T或207位為T，則鑒定為三七，如果自SEQ?ID?No.1所示序列的5’端起第140位和第207位不是T，則待鑒定樣品不是三七。本發明專利技術能夠實現三七原植物及其近緣種、藥材、生飲片、粉未和混淆品的快速、準確鑒定。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術術語中藥材來源品種鑒定
，具體涉及用特異的SNP鑒定三七的方法。
技術介紹
三七(Panax notoginseng (Burk. ) F. H. Chen)是人參屬多年生植物,是我國傳統中藥材，含有多種生物活性成分。三七是名貴中藥材，具有散瘀止血，消腫定痛之功效。可治療各種出血癥,人參“補氣第一”，三七“補血第一”，味同而功亦。三七與人參(Panax ginsengC. A. Mey)、西洋參(Panax quinquefolium L.)、竹節參(Panax japonicus C. A. Mey.)及其變種狹葉竹節參(Panax japonicus C. A. Mey. var. angustifius (Burk) Cheng et Chu)、珠子參(Panax japonicus C. A. Mey. var. major (Burk) C. Y. Wu et Κ. M. Feng)、姜狀三七(Panax zingiberensis C. Y. Wu et K.)、屏邊三七(Panax stipuleanatus Tsai et Feng)和假人參(Panax pseudoginseng Wall.)均作為藥物使用，它們來源于同科、同屬，為親緣關系相近的植物，這幾種藥物在藥性和功效方面有很大區別，尤其是三七歸為活血、止血類藥物而非滋補性藥物，在中醫臨床上也區別使用。三七藥材價格昂貴，市場上常出現其混偽品。由于三七與其近緣種、混偽品外形類似，傳統的性狀鑒別對三七與其近緣種的鑒定有一定困難，尤其對于藥材市場存在的三七切片、粉末、種子和種苗的鑒別具有更大障礙。這就需要尋找到一種穩定可靠的方法將三七藥材、飲片、粉末加以鑒定區分。
技術實現思路
本專利技術第一個目的在于提供三七鑒定用SNP標記。本專利技術第二個目的在于提供三七鑒定用SNP標記在三七鑒定中的應用。本專利技術第三個目的在于提供本專利技術提供的三七鑒定用SNP標記，其核苷酸序列如SEQ ID No. I所示，其中，SEQID No. I所示序列的5’端起第140位三七為T，其他物種為A或缺失；第207位三七為T，其他物種為C或A。本專利技術提供的SNP可用于鑒定三七，如果自SEQ ID No. I所示序列的5’端起第140位為T或第207位為T，則鑒定為三七，如果自SEQ ID No. I所示序列的5’端起第140位和第207位不為T，則待鑒定樣品不是三七。本專利技術提供的三七鑒定方法，其包括如下步驟I)以待測樣品DNA為模板，擴增含有SEQ ID No. I所示序列的片段；2)對擴增產物進行測序，拼接后去除序列兩端5. 8S和26S基因區，獲得完整ITS2基因間隔區，通過分析SEQ ID No. I所示的序列，確定自SEQ ID No. I所示序列的5’端起第140位或第207位的堿基。其中，如果自SEQ ID No. I所示序列的5’端起第140位為T或第207位為T，則鑒定為三七，否則不是三七。本專利技術擴增時使用的弓丨物序列為ITS2F 5' -ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3'ITS3R 5' -GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'上述引物用于擴增三七的ITS2序列。本專利技術還提供含有上述弓I物的試劑盒。本專利技術提供了上述試劑盒在三七鑒定中的應用。本專利技術方法適用性更廣，能檢測所有能提取出DNA的三七任何樣品。因此，能夠實現三七原植物與近緣種、藥材、生飲片、粉末與混淆品的快速、準確鑒定。 附圖說明圖I所示為ITS2序列的擴增結果，其中1-11分別代表SN01-SN11的擴增結果，CK為陰性對照。圖2所示為三七(P. notoginseng)的三個種內變異類型。圖3所示為三七(P. notoginseng)和其他物種ITS2序列的比對結果，其中圖3a為ITS2基因間隔區，5’端起第140位，三七為T，其他物種為A或缺失；圖3b為在第207位，三七為T，其他物種為C或A。圖4所示為三七與混偽品構建NJ樹結果。具體實施例方式以下實施例用于說明本專利技術，但不用來限制本專利技術的范圍。實施例I三七藥材原料的鑒定方法I)從不同藥材商店和道地產地(云南)收集的24份三七樣品，分別取20mg藥材，在MM400球磨儀(德國Retsch)上進行研磨，用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因組DNA試劑盒提取總DNA。表I三七樣品信息表l-f'J-編 O_§#_購買商I,tT_1soi三七《報)北京好得快藥房農大路(I)^2SQ02三七(根)北京好得快藥房農大路(2)3SQ03三七(根)北京宏生堂農大路店4SQ04三七(根)北京濟安堂五道口店5SQ05三七(根)北京同仁堂百tt店(1)6SQ06三七(根)北京同仁堂北新撟店7SQ07三七(根)北京同仁堂西苑店 8SQ08三七(拫)北京同芝堂東單店9SQC)9三七(根)北京中衛神州大藥房10SQlO三七(拫)北京永安堂百萆藥店王府弁店11SQll三七(根)云南(道地藥tt)12SQ12三七(根)云南(道地藥材)13SQ13三七(根)云南(道地藥材)14SQ14三七(根)北京同仁堂冒旺店(2)15SQ15三七(根)北京同仁堂北京站店16SQ16三七(根)北京同仁堂崇文門店17SQ17三七《極)北京同仁堂王.府井店18SQiX三七(根)北京京隆堂崇文門店19SQ19三七(振)云南(遁地藥紂)20SQ20三七(根)云南(遒地藥材)21SQ21三七《根)云南(道地藥材)22SQ22三七《拫)云南(道地藥材)23SQ23三七(拫)云南(遒地藥材)24_SQ24_三七(根)云南(遒地藥翁)_2) PCR 擴增引物序列為ITS2F ATGCGATACTTGGTGTGAAT ； ITS3R GACGCTTCTCCAGACTACAAT,由生工生物工程公司有限公司(北京)合成。引物用無菌去離子溶解并稀釋至2 μ mol/μ L。25 μ L 反應體系PCR Buffer (IOX) 2· 5 μ L, Mg2+ 2 μ L(25mmol/L)，dNTPs 混合物2μ L (2. 5mmol/L)，引物各 I. O μ L (2· 5 μ mol/L)，模板 DNA I μ L (-約 30ng)，Taq DNA 聚合酶I. OU,加滅菌雙蒸水至25 μ L，進行PCR擴增。PCR反應程序在PCR儀上按照以下程序進行擴增反應 94°C, 5 min 940C, 30 s ^56eC, 30 s 40 > 72。。, 45 s-72 eC, 10 miiie分別取5 μ L的PCR擴增產物上樣，用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳后在凝膠成像儀上檢測結果。(圖I)3)測序PCR產物直接送中國農業科學院重大工程實驗室測序。測序引物同本專利技術的ITS2F和ITS3R的PCR引物。為確保DNA條形碼序列的可靠性，需要進行正反向測序或重復測序，然后將正反向測序結果進行拼接獲得DNA條形碼序列。 4)序列拼接本實施例米用應用軟件CodonCode Aligner 3.7.1 (CodonCode Co. , Germany)進行序列拼接及校對。首先，進行測序質量評估及預處理，即去除測序結果兩端的低質量部分，并對剩余部分進行本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種三七鑒定用SNP標記，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ？ID？No.1所示，其中，SEQ？ID？No.1所示序列的5’端起第140位為T或第207位為T。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：廖保生，韓建萍，陳曉辰，陳士林，
申請(專利權)人：中國醫學科學院藥用植物研究所，
類型：發明
國別省市：
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