本發明專利技術公開了一種檢測黃牛PPARGC1A基因單核苷酸多態性的方法，以包含PPARGC1A基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增黃牛PPARGC1A基因，再進行瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物片段大小；然后進行SSCP多態性的檢測。該方法是一種在DNA水平上篩查和檢測與黃牛生長性狀密切相關的分子遺傳標記，故本發明專利技術提供的檢測方法可用于中國黃牛肉用和生長性狀的分子標記輔助選擇，進而快速建立遺傳資源優良的黃牛種群。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于分子遺傳學領域，涉及基因單核苷酸多態性的檢測，特別涉及一種檢測黃牛PPARGC1A基因單核苷酸多態性的方法。
技術介紹
單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)是由美國麻省理工學院的人類基因組研究中心的學者Lander(1996)提出的一類遺傳標記系統，就是指基因組DNA序列中由于單個核苷酸(A/T/C/G)的變化而引起的多態性。它的變異形式有顛換、轉換、插入和缺失等，主要由單個堿基的轉換或者顛換所引起。具有轉換型的堿基變異的SNPs約占2/3。在任何已知或未知的基因內或附近都可能找到數量不等的SNPs，基因編碼區內的SNPs(cSNPs)比較少，因為在外顯子內的變異率僅占周圍序列的1/5，但它在遺傳病和育種的研究中卻具重要意義，因此倍受關注。標記輔助選擇就是將現代生物技術與常規選擇方法相結合，通過對遺傳標記的選擇來間接選擇控制某性狀的數量性狀位點(QTL)，使之能夠同時利用標記位點信息和數量性狀的表型信息，更準確估計動物個體的育種值，提高選擇效率，加快育種進展。標記輔助選擇主要經歷了三個階段第一階段是家畜各性狀間的遺傳分析；第二階段是蛋白質(酶)標記對數量性狀的標記階段；第三個階段是分子遺傳標記階段。隨著分子標記技術日漸成熟與豐富，使覆蓋整個基因組的標記成為可能，通過與QTL間的連鎖分析，實現分子標記輔助選擇的目標。SNP作為新的遺傳標記已廣泛應用于基因定位、克隆、遺傳育種及多樣性的研究。分子育種，即分子標記輔助選擇(molecularmark-assist selection, MAS),該技術是借助DNA分子標記對遺傳資源或育種材料進行選擇，對畜禽的綜合性狀進行品種改良，它是利用現代分子生物學和傳統遺傳育種相結合的方法，進行新品種選育。在畜禽育種中，人們期望，通過對生長性狀密切相關，并且與數量性狀緊密連鎖的DNA標記的選擇，達到早期選種和提高育種值準確性的目的，從而在畜禽育種中獲得更大的遺傳進展。近年來，人們發展了許多用于探尋分子遺傳標記的方法，最常見的有單鏈構象多態技術(SSCP) ,PCR-RFLP和直接測序技術等，SSCP它可以發現靶DNA片段中未知位置的堿基突變。Takao經實驗證明小于300bp的DNA片段中的單堿基突變，90%可被SSCP發現，他認為現在知道的所有單堿基改變絕大多數可用該方法檢測出來。另外，SSCP方法可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同遷移率的突變單鏈DNA分離，并且還可以進一步提純。用這種方法可以最終從DNA序列水平上鑒別突變DNA片段。該方法簡便、快速、靈敏，不需要特殊的儀器。過氧化物酶體增殖激活受體Y共激活因子(peroxisome proIiferator-activatedreceptor coactivator I alpha, PGC-1 a ),編碼基因為PPARGC1A,是轉錄共激活因子家族的一員，可以被冷刺激強烈誘導表達，刺激適應性產熱以適應環境，在細胞能量代謝方面起重要作用。PGC-Ia參與多種代謝過程，包括線粒體的生物合成、葡萄糖的攝取、肝臟糖異生、脂肪酸β氧化、脂肪細胞分化、肌肉類型轉換等。在人類醫學研究中，PPARGC1A主要用來研究一些與代謝相關的疾病，如能量代謝障礙疾病、肥胖癥、糖尿病等。在動物遺傳育種研究中，由于PGC-Ia參與機體能量平衡和脂肪代謝調控的整個過程，PPARGC1A基因被作為影響動物生長、疾病發生和生物體內各種物質合成的侯選基因，研究動物的生長發育、肉類品質及產乳特性。然而未見在中國黃牛PPARGC1A基因遺傳多態性及其對黃牛生長性狀相關效應研究的報道。目前中國黃牛PPARGC1A基因遺傳變異領域的研究匱乏，該基因位點的功能研究及其遺傳變異與生長發育性狀(如初生重、體重、日增重、體高、體重、體斜長、坐骨端寬等生長性狀)關聯的研究仍是空白
技術實現思路
本專利技術解決的技術問題在于提供一種檢測黃牛PPARGC1A基因單核苷酸多態性的方法，尋找與經濟性狀關聯的SNP作為分子標記，加快具有優質經濟性狀黃牛種群的建立。本專利技術通過以下技術方案來實現一種檢測黃牛PPARGC1A基因單核苷酸多態性的方法，其特征在于，以包含PPARGC1A基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以弓丨物對P為引物，PCR擴增黃牛PPARGC1A基因；瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物片段大小；用變性劑處理PCR擴增產物之后，再對變性后的擴增片段進行聚丙烯酰胺凝膠電泳；根據聚丙烯酰胺凝膠電泳結果鑒定黃牛PPARGCIA基因第64897位的單核苷酸多態性；所述的引物對P為上游引物5’-TCCTCTGTTTTACTGTCTTTG-3’下游引物5’-GTGCTTGGGGATTATTTTGG-3’。所述的PCR擴增反應程序為95°C 預變性 4min ;94°C 變性 30s，51°C退火 30s，72°C 延伸 30s，34 個循環；72°C 延伸 IOmin0瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物片段大小，所用的瓊脂糖凝膠的質量濃度為I. 5%。所述的聚丙烯酰胺凝膠電泳質量濃度為10%。所述根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑒定黃牛PPARGC1A基因第64897位的單核苷酸多態性為GG基因型表現為64897位為核苷酸G純和；GA基因型表現為64897位為核苷酸G/A雜合；AA基因型表現為64897位為脫氧核苷酸A純和；其中，單核苷酸多態性AA基因型為突變純合基因型。與現有技術相比，本專利技術具有以下獨特的技術效果本專利技術根據已公布牛PPARGC1A 基因(GenBank Accession No. NC_007304)的序列設計引物，分別以3個黃牛品種的基因組DNA為模板，進行PCR擴增，并對PCR產物進行測序，將測序后得到的黃牛PPARGC1A基因的部分序列與NCBI公布的序列進行比較，發現在PPARGCIA基因的第64897位存在SNP多態性。針對上述第64897位的SNP多態性，本專利技術還公開了其篩查和檢測方法，進行PCR擴增后，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物片段大小，用變性劑處理擴增產物后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，能夠簡單、快速、低成本、精確地檢測其單核苷酸的多態性。由于PPARGC1A基因功能涉及初生重、體重、日增重、體高、體重、體斜長、坐骨端寬等生長性狀，本專利技術提供的檢測方法為PPARGC1A基因的SNP與黃牛部分生長性狀進行關聯分析，結果表明該位點能夠作為提高黃牛體重和日增重的分子標記，以便用于中國黃牛肉用生長性狀的標記輔助選擇(MAS)，快速建立遺傳資源優良的黃牛種群。附圖說明圖I是本專利技術的技術流程示意圖。圖2是本專利技術中PCR產物混合測序篩查到的黃牛PPARGC1A基因序列64897位G-A突變測序結果圖(箭頭所指處為單核苷酸突變位置，自上至下分別為GG、GA和AA基因型的測序結果圖)。圖3是本專利技術用來檢測PCR產物片段大小的瓊脂糖凝膠電泳(泳道1、2、3、4分別 代表不同黃牛個體的PCR擴增產物)。圖4是本專利技術用來檢測各樣本突變情況的聚丙烯酰胺凝膠電泳(自左至右泳道分別代表基因型GA、GG、GG和AA的電泳帶型)。具體實施例方式本專利技術首先根據NCBI公布的PPARGC1A基因序列(GenBank Acce本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種檢測黃牛PPARGC1A基因單核苷酸多態性的方法，其特征在于，(1)以包含PPARGC1A基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增黃牛PPARGC1A基因，所述的引物對P為：上游引物：5’？TCCTCTGTTTTACTGTCTTTG？3’下游引物：5’？GTGCTTGGGGATTATTTTGG？3’；(2)用瓊脂糖凝膠電泳檢測步驟(1)中PCR擴增產物片段大小；(3)用變性劑處理步驟(1)中PCR擴增產物之后，再對變性后的擴增片段進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據聚丙烯酰胺凝膠電泳結果鑒定黃牛PPARGC1A基因第64897位的單核苷酸多態性。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：陳宏，李密杰，劉梅，劉棟，藍賢勇，雷初朝，
申請(專利權)人：西北農林科技大學，
類型：發明
國別省市：
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