肝豆狀核變性致病基因突變檢測試劑盒制造技術

本實用新型專利技術公開了一種肝豆狀核變性致病基因突變檢測試劑盒，其特征在于，包括包裝盒體，包裝盒體內的中間設有口腔拭子，口腔拭子的一側設有樣本保存管和含有PCR擴增試劑的試管，另一側設有含有PCR產物純化試劑的試管和含DNA測序試劑的試管。本實用新型專利技術將樣本采集、肝豆狀核變性致病基因突變位點檢測整合在一個試劑盒內，使用更方便快捷，且成本更低。（*該技術在2022年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】

本技術提供了一種肝豆狀核變性致病基因突變檢測試劑盒，屬于分子生物學

技術介紹
P型ATP酶(ATP7Base，ATP7B)基因定位于13ql4. 3，全長約80kb，含有21個外顯子和20個內含子，其cDNA編碼一種由1411個氨基酸組成的P型銅轉運ATP酶。該酶主要分布在肝、腎和胎盤，而少見于心、腦、肺和肌肉等組織，其主要生物學功能是在高爾基體內接受銅伴侶蛋白傳遞的銅，合成銅藍蛋白，另外可以在高銅環境下重新定位，攜帶所結合的銅促使其從膽汁中排出。當ATP7B基因發生突變，其編碼的P型ATP酶功能會部分或全部喪失，不能將多余的銅離子從細胞內轉運出去，使銅離子在特定的器官和組織沉積，進而導致肝豆狀核變性的發生。肝豆狀核變性又稱Wilson病(Wilson' s disease，WD)，是一·種呈常染色體隱性遺傳的銅代謝缺陷病。國外的流行病學調查顯示，其發病率為1/10000至1/30000，基因頻率為0.3% _0.7%，雜合子頻率估計為1/100。我國南方發病率約為1/10000，據神經遺傳專科門診病例分析報道，Wilson病居全部單基因遺傳病的第二位。目前，國內外已發現ATP7B基因突變200余種，這些突變位點幾乎分布于ATP7B基因的各個外顯子，甚至有的還分布在內含子或剪接區內，突變類型包括錯義突變、無義突變、缺失和插入等，ATP7B的突變方式多種多樣，但主要以點突變為主，且多累及ATP酶功能區，而不是金屬離子結合區。并且在不同地域人群中所發現的熱點突變區明顯不同。1995年Thomas等報道了 3例中國香港人ATP7B患者，他們的ATP7B基因上都存在R778L (exon8)純合突變，這是有關中國人該病基因外顯子突變類型的首次報道。1996年臺灣學者Chuang等報道在臺灣ATP7B患者中檢測到了該位點的兩種突變R778L和R778Q，突變率分別為11.4%和9.1%。上海劉曉青等報道R778L突變頻率為47. 2%，未發現R778Q突變。Ye等對中國東部50例ATP7B患者研究后指出，R778L突變頻率高達60 %。進一步研究表明，我國ATP7B與白種人的外顯子突變特點有明顯差異，第8號外顯子R778L突變是中國人群的高頻突變點，其突變頻率為11. 4% 60%。Park等檢測了 120例韓國ATP7B患者，R778L突變頻率達39. 2%，同時日本研究結果也表明R778L是高頻突變點。8號外顯子位于ATP7B蛋白的跨膜功能區，該位點的突變可引起蛋白的I級和2級結構改變，導致銅轉運在細胞膜上停滯。12號外顯子的T935M突變也是我國肝豆狀核變性基因突變熱點，在吳志英等對44例肝豆狀核變性患者的研究中指出，18. 1%的患者在12號外顯子上檢測到突變，其中T935M突變占6. 8%,G943D占2. 3%，此2種突變國外均未見報道。綜上所述，ATP7B基因突變位點和形式多種多樣，中國人群中WD患者ATP7B基因外顯子8與外顯子12的點突變最為常見。
技術實現思路
本技術的目的是提供一種檢測肝豆狀核變性致病基因是否發生突變的試劑盒。為實現以上目的，本技術提供了一種肝豆狀核變性致病基因突變檢測試劑盒，其特征在于，包括包裝盒體，包裝盒體內的中間設有口腔拭子，口腔拭子的一側設有樣本保存管和含有PCR擴增試劑的試管，另一側設有含有PCR產物純化試劑的試管和含DNA測序試劑的試管。本技術將樣本采集、肝豆狀核變性致病基因常見突變位點檢測整合在一個試劑盒內，使用更方便快捷，且成本更低。本技術基于直接測序技術，可以對PCR產物直接進行DNA序列分析，明確突變位點，是現有基因突變檢測方法中最直接最準確的方法，且可以實現機械化自動化，使測序工作更加簡便快捷，結果判讀更直觀。附圖說明圖I為本技術提供的一種肝豆狀核變性致病基因突變檢測試劑盒結構示意圖；圖2為ATP7B基因第8號外顯子實驗無突變的結果示意圖；圖3為ATP7B基因第8號外顯子實驗有突變的結果示意圖；圖4為ATP7B基因第12號外顯子實驗無突變的結果示意圖；圖5為ATP7B基因第12號外顯子實驗有突變的結果示意圖。具體實施方式為使本專利技術更明顯易懂，茲以優選實施例，并配合附圖作詳細說明如下。實施例如圖I所示，為本技術提供的一種肝豆狀核變性致病基因突變檢測試劑盒的結構示意圖，包括帶盒蓋的包裝盒體1，包裝盒體I內的中間設有口腔拭子2，口腔拭子2的一側設有樣本保存管3和含有PCR擴增試劑的試管4，另一側設有含有PCR產物純化試劑的試管5和含DNA測序試劑的試管6。測試步驟如下步驟I :采集檢測樣品用口腔拭子2在被測者口腔左右兩腮分別各上下刮20次，保證采集到足量的細胞樣本，采集完畢，樣本保存于樣本保存管3中。步驟2 :采用硅膠吸附法抽提樣本的基因組DNA。步驟3:PCR擴增PCR 擴增試劑(總體積為 Iml)的成分包含20mM Tris-HCL (PH8. O)、IOOmM KCL,500uM dNTPs、3mM MgCl2 溶液、0. IU Taq DNA 聚合酶/ul。ATP7B基因第8外顯子正向和反向引物正向引物ctcttggtcatccattcctg ；反向引物catggtgttcagaggaagtgag。ATP7B基因第12外顯子正向和反向引物正向引物actggtggaagaggctcaga；反向引物cctgcagaaggagagtgactg。然后在ABI9700型PCR擴增儀上進行，分為2個反應孔，每個反應孔分別放入I對ATP7B引物，每對正反向引物各O. 5ul (引物濃度為IOumoI/L)，各加入檢測樣品2ul，PCR反應液7. 5ul，去離子水4. 5ul，反應孔總體積15ul。反應條件為95°C預熱10分鐘；再進行35個循環的95°C、45秒，60°C、45秒，72°C、60秒；72°C、7分鐘后，降溫至4°C。步驟4 =PCR產物純化每一個反應孔反應體系總體積為7ul，由PCR產物純化試劑4ul和PCR產物3ul組成。反應條件為37°C、60分鐘；80°C、15分鐘。 步驟5 DNA測序反應 每一個反應孔反應體系總體積為5ul，由PCR純化產物Iul、DNA測序試劑Iul、測序引物Iul和去離子水2ul組成。反應條件為96°C2分鐘；25個循環的96°C、10秒；50°C、5 秒；60°C、4 分鐘；60°C、4 分鐘。反應結束后每管加入Iul 125mM乙二胺四乙酸EDTA和無水乙醇15ul，室溫沉淀15分鐘；3650轉/分，4°C離心30分鐘，輕輕倒去上清液；每孔加30ul 70%乙醇，3650轉/分，4°C離心15分鐘，倒去上清液；室溫放置20分鐘后加入HIDI溶液8ul，上測序儀。步驟4:結果分析在測序儀上進行結果讀取，用軟件Chromas查閱測序檢測結果。I.未檢出突變未發現ATB7B基因存在突變；2.檢出突變(I)發現ATB7B基因第8外顯子上存在突變；(2)發現ATB7B基因第12外顯子上存在突變。在測序儀上進行結果讀取，用軟件ChiOmas查閱測序檢測結果。若ATB7B基因無突變，則分析結果如圖2和圖4所示；若ATB7B基因第8號外顯子存在突變，則分析結果如圖3所示；若ATB7本文檔來自技高網...

【技術保護點】
肝豆狀核變性致病基因突變檢測試劑盒，其特征在于，包括包裝盒體(1)，包裝盒體(1)內的中間設有口腔拭子(2)，口腔拭子(2)的一側設有樣本保存管(3)和含有PCR擴增試劑的試管(4)，另一側設有含有PCR產物純化試劑的試管(5)和含DNA測序試劑的試管(6)。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：潘峰，卞雪蓮，毛丹丹，
申請(專利權)人：上海中優醫藥高科技有限公司，
類型：實用新型
國別省市：