五重熒光PCR快速超敏檢測試劑盒及其應用制造技術

本發明專利技術涉及在單個PCR反應容器中五重檢測核酸提取液中靶核酸的實時PCR方法，用于檢測樣品中淋病奈瑟菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人型支原體和生殖支原體。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于核酸檢測
，具體而言，本專利技術涉及能同時對沙眼衣原體、淋病奈瑟菌、解脲支原體、人型支原體和生殖支原體等五種致病病原體進行檢測的多重實時PCR方法，其快速、超敏且一步完成。另外，本專利技術還涉及上述PCR方法中所涉及的試劑，如互不相干繞的引物、探針等，以及用于上述方法的檢測試劑盒和相應檢測試劑盒的制備應用等。
技術介紹
淋病奈瑟菌(NG)、沙眼衣原體(CT)、解脲支原體(UU)、人型支原體(MH)、生殖支原體(MG)是引起泌尿生殖系統感染的5種主要病原體，可引起尿道炎、前列腺炎、宮頸炎、輸卵管炎甚至不孕不育等。其中，淋病奈瑟菌(Niesseria gonorrhoeae, NG)是引起淋病的病原體，而淋病一直是性傳播疾病中最常見的疾病，可引起嚴重的泌尿生殖道疾病，尤其是女性患者常導致盆腔炎癥性疾病和繼發不孕；沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis, CT)也是重要的性傳播疾病的病原體之一，可以導致陰道、尿道和上行的生殖道感染，也能導致盆腔炎、輸卵管損傷；解脲支原體(Ureaplasma urealyticum, UU)是引起泌尿生殖道炎癥(NGU)及男女不育不孕的主要病原體，也是性傳播的常見病原體，是常見的泌尿生殖寄生物；人型支原體(Mycoplasma hominis, MH)是成人泌尿生殖道的一種常見的微生物，和某些婦科、男性疾病有關，也和新生兒呼吸道感染、中樞神經系統感染有關；生殖支原體(Mycoplasma genitalium, MG)可引起非淋菌性尿道炎(NGU)、前列腺炎、宮頸炎、子宮內膜炎、附件炎及不孕，同時可能在HIV感染中起著重要的作用，被稱為“AIDS相關支原體”。美國自1995年開展生殖道衣原體感染病例報告工作以來，其發病率很高，在180/萬以上；非洲性病發病率更高，如津巴布韋衛生系統較為完善，全國1000多萬人口，I年報告的性病病例就達80萬，占總人口近10%。而隨著我國改革開放的不斷深入，社會經濟不斷發展，人口流動不斷加強，性病的感染的有逐年上升的趨勢，目前我國淋病和梅毒發病率高于發達國家，低于非洲國家，而且我國性病的發病率仍保持快速增長，1991 - 2000年全國性病平增長19. 30%，尤其是梅毒、生殖器皰疹和N⑶增長幅度在40%以上，而且性病和艾滋病的流行密切相關，性病的流行將促進艾滋病的傳播?，F在對淋病奈瑟菌、解脲支原體、人型支原體、生殖支原體的檢測主要以培養法為主；沙眼衣原體主要針對其抗原進行免疫學檢測。培養法檢測耗時長，一般需經48-72小時才能得到結果；靈敏度低，受采集、運送、保存等影響較大，容易出現假陰性結果；操作煩瑣，導致各種操作的結果判別標準難以統一，需要的技術和設備要求高。免疫學方法相比培養法有了長足的進步，但是因為生殖道微生物之間存在的交叉反應使得該方法的特異性受到影響，容易出現假陽性反應，給治療帶來誤判的可能。近年也有報道利用聚合酶鏈反應(PCR)來實施對病原體的檢測。PCR是當今核酸檢測中最常用的技術之一，其中實時(Real Time)PCR技術采用了諸如熒光標記等可實時檢測的標記，在核酸檢測、臨床診斷及分子生物學研究等方面，可以快速地獲得結果。常規的實時 PCR 檢測，如中國專利 CN1768151A、CN101189505A、CN101273262A、CN101302473A 等，僅用于檢測單一靶核酸；中國專利CN101624629A公開了(在單個PCR反應容器中)多重檢測樣品中靶核酸的實時PCR方法，執行速度更快、更整合，但是其僅僅用于檢測HBV、HCV和HIV等三種靶核酸，沒有更多重檢測的實踐，例如沒有關于如何設計互不干擾的引物對和探針的提示，更沒有提示對探針濃度的進行調整。然而，對于更多重的實時PCR檢測，尤其是對于淋病奈瑟菌(NG)、沙眼衣原體(CT)、解脲支原體(UU)、人型支原體(MH)、生殖支原體(MG)這五種病原體(其中三種支原體的同源性較高)來說，通過目前已知的引物對和探針序列設計方法(包括現有的生物信息學軟件)，無法設計出這五重互不干擾的引物對和探針，設計出的將導致互相干擾而使得熒光檢測曲線失真。為此，本專利技術人經過艱苦的努力并且憑借了一些運氣，針對這五種病原體，設計出了互相干擾程度在實時PCR檢測中可接受的引物對和探針，更令人意外的是，在探針濃度上進行了調整，增強了它們的檢測曲線都能的清晰度和分辨度(曲線相互分離)，使得檢測靈敏度達到了超敏級，而且可以不使用內對照。另外，本專利技術對于上述微生物的核酸提取方法進行了優化。
技術實現思路
本專利技術的要解決的問題在于提供新的五重實時PCR方法，用于五重檢測樣品中淋病奈瑟菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人型支原體和生殖支原體，通過互相干擾程度在實時PCR檢測中可接受的引物對和探針，并任選優化探針濃度和核酸提取的過程，可以同時高特異性、高靈敏度和高重復性地分辨出樣品中是否存在來自上述微生物的靶核酸。另外，本專利技術還涉及提供上述方法的檢測試劑盒和應用等。具體而言，在第一方面，本專利技術提供了在單個PCR反應容器中五重檢測核酸提取液中靶核酸的實時PCR方法，所述靶核酸來自淋病奈瑟菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人型支原體和生殖支原體，其包括，(I)在所述單個PCR反應容器中混合核酸提取液、DNA聚合酶、dNTP、靶核酸引物對和靶核酸探針，其中所述探針標記有熒光基團和淬滅基團，而且各種探針標記的熒光基團的熒光檢測波長互不相同，其中，靶核酸引物對包括 NG-F:ACCGTAACGTCTCTAAGTC,NG-R:GCAAGATTTCCGATTTGGC,CT-F:TGTCCATATCTTTGATACGAT,CT-R:CTCTGATATTTGAAGACTCTACA,UU-F:CTGCTCGTGAAGTATTACA,UU-R:GTACCATCTGGGAAAGTAC,MH-F:TGTGGTTTAATTTGAAGATACAT，MH-R:AGTCCTCAACTTAATGTTAGA,MG-F:AGGCAGTAATGTCAATCACA,和MG-R:GGCTTTATCATTGGCAAACG，靶核酸探針包括NG-P:CAGACATCACGCACCGAAGCAT，CT-P:CCAAGCCGAGTCTACAGTTATAGGTCA，UU-P:ACCAACCATTGTATCTACACCTTCCATA，MH-P:CCACTCTTGACATCCTTCGCATA，和MG-P:CCATTCGCATCCAACTTCACCTCT ；(2)進行PCR反應，并實時檢測不同波長的熒光；和，(3)根據熒光檢測結果計算出的Ct值判斷是否有靶核酸存在于樣品中。可以對核酸提取液進行直接檢測，但是優選對樣品進行處理后獲得核酸提取液后再進行檢測。所以，優選核酸提取液是提取樣品中的核酸而獲得的提取液，如是采用磁珠提取法提取的。非特異性的磁珠提取法采用表面涂有非特異性核酸吸附類物質的順磁性顆粒，在低PH(如，pH值5 7)和高鹽濃度的情況下核酸可以吸附到順磁性顆粒表面，在進行磁 分離和充分洗滌后，在高pH(如，pH值8、)、低鹽濃度的條件下可將核酸洗脫下來，由此富集了核酸(如靶核酸)的樣品可用于PCR試驗；另外還可以采用特異性吸附(如本文檔來自技高網...

【技術保護點】
在單個PCR反應容器中五重檢測核酸提取液中靶核酸的實時PCR方法，所述靶核酸來自淋病奈瑟菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人型支原體和生殖支原體，其包括，（1）在所述單個PCR反應容器中混合核酸提取液、DNA聚合酶、dNTP、靶核酸引物對和靶核酸探針，其中所述探針標記有熒光基團和淬滅基團，而且各種探針標記的熒光基團的熒光檢測波長互不相同，其中，靶核酸引物對包括ACCGTAACGTCTCTAAGTC，GCAAGATTTCCGATTTGGC，TGTCCATATCTTTGATACGAT，CTCTGATATTTGAAGACTCTACA，CTGCTCGTGAAGTATTACA，GTACCATCTGGGAAAGTAC，TGTGGTTTAATTTGAAGATACAT，AGTCCTCAACTTAATGTTAGA，AGGCAGTAATGTCAATCACA，和GGCTTTATCATTGGCAAACG，靶核酸探針包括：CAGACATCACGCACCGAAGCAT，CCAAGCCGAGTCTACAGTTATAGGTCA，ACCAACCATTGTATCTACACCTTCCATA，CCACTCTTGACATCCTTCGCATA，和CCATTCGCATCCAACTTCACCTCT；（2）進行PCR反應，并實時檢測不同波長的熒光；和，（3）根據熒光檢測結果計算出的Ct值判斷是否有靶核酸存在于樣品中。...

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：陳悅科，張文艷，劉明霞，葉成果，王奕江，沈靖，
申請(專利權)人：蘇州華益美生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：