甲基化DNA的檢測制造技術

描述了離子敏場效應晶體管（ISFET）在檢測DNA樣品中甲基化的核苷酸中的應用。一種檢測DNA樣品中甲基化的核苷酸的方法，可以包括以下步驟：使用區別甲基化的和非甲基化的核苷酸的試劑處理DNA樣品，以提供處理的DNA；對所述處理的DNA進行擴增；以及可選擇地對擴增的DNA進行測序。將ISFET用于監測在擴增和/或測序步驟中的鏈延伸反應期間一個或多個dNTP的添加。還提供了合適的裝置。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及一種傳感裝置和方法，尤其涉及一種適合檢測甲基化DNA的傳感裝置和方法。
技術介紹
在化學科學中，甲基化表示甲基基團加入到底物上或者原子或基團被甲基基團取代。甲基化是特定的甲基基團而不是更大的碳鏈取代氫原子的烷基化形式。這些術語通常用在化學、生物化學、土壤科學和生物科學中。在生物系統中，甲基化由酶催化；這種甲基化可以參與重金屬的修飾，基因表達的調控、蛋白功能的調控，以及RNA代謝。重金屬的甲基化也可以發生在生物系統外。組織樣 品的化學甲基化也是減少特定組織學染色偽差(histological staining artefacts)的一種方法。脊椎動物中的DNA甲基化通常發生在CpG位點(胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤位點；即，在DNA序列中在該位點胞嘧啶后直接為鳥嘌呤)；這種甲基化導致胞嘧啶轉化為5-甲基胞嘧啶。Me-CpG的形成由DNA甲基轉移酶催化。大部分哺乳動物的DNA有大約40%的CpG位點被甲基化，但存在富含GC (由大約65%的CG殘基組成)的被稱為CpG島的特定區域，該區域內CpG位點不被甲基化。這些與56%的哺乳動物基因的啟動子相關，所述哺乳動物基因包括所有無所不在地表達的基因。1-2%的人類基因組為CpG簇，并且在CpG甲基化和轉錄活性之間存在逆相關。DNA甲基化涉及在胞嘧啶嘧啶環的5位置或腺嘌呤嘌呤環的第6位氮(胞嘧啶和腺嘌呤為DNA的四個堿基中的兩個)上加入甲基基團。這種修飾可以通過細胞分裂遺傳。DNA甲基化通常在受精卵形成階段被去除并且在發育階段通過連續的細胞分裂被重建。DNA甲基化是高等生物中正常機體發育和細胞分化的重要部分。DNA甲基化穩定地改變細胞中基因的表達模式以便細胞能夠“記得它們曾在何處”；換句話說，在胚胎發育期間程序化為胰島的細胞在機體的整個生命中依然為胰島，但沒有持續的信號告訴它們需要依然為胰島。另外，DNA甲基化抑制病毒基因和其它有毒元件(該有毒元件已隨著時間整合到了宿主的基因組中)的表達。DNA甲基化也形成染色質結構的基礎，這使細胞能夠形成來自單一非突變的DNA序列的多細胞生命所必需的多數特征。DNA甲基化還在幾乎所有類型的癌癥發展中起著重要的作用。DNA甲基化涉及在DNA上加入甲基基團——例如，在胞嘧啶嘧啶環的第5位碳上——在這種情況下具有降低基因表達的特殊效果。在成人的體組織中，DNA甲基化通常發生在CpG 二核苷酸環境中；非CpG的甲基化在胚胎干細胞中是普遍的。亞硫酸氫鹽測序法是利用亞硫酸氫鹽處理DNA以確定它的甲基化模式。DNA甲基化是首次發現的表觀遺傳標記(epigenetic mark),并且仍然是研究最多的。它還參與轉錄活性的抑制。使用亞硫酸氫鹽處理的DNA將胞嘧啶殘基轉變為尿嘧啶，但保留了不受影響的5-甲基胞嘧啶殘基。因此，亞硫酸氫鹽處理在DNA序列中引入了特定的改變，這種改變依賴于個體胞嘧啶殘基的甲基化狀態，產生有關DNA片段甲基化狀態的單核苷酸分辨率信息(single-nucleotide resolutioninformation)。可以對改變的序列進行多種分析以獲得這種信息。這種分析的目的因此變為區分由亞硫酸氫鹽轉變導致的單核苷酸多態性(胞嘧啶和胸腺嘧啶)。可以通過焦磷酸測序進行測序,這不同于雙脫氧測序(Sanger sequencing),焦磷酸測序依賴于核苷酸摻入上釋放的焦磷酸的檢測，而不依賴于雙脫氧核苷酸的鏈終止反應。使用Infinium II 平臺的 Illumina 甲基化試驗(Illumina Methylation Assay)利用“珠狀芯片(BeadChip)”技術產生人類DNA甲基化的綜合基因組圖譜(comprehensivegenome wide profiling),與亞硫酸氫鹽測序和焦磷酸測序相似。根據Staaf等 (2008), "Infinium II試驗似乎在熒光檢測中使用的兩個通道之間存在染料強度偏差(dye intensity biases)。另外，即使數據通過在BeadStudio軟件中使用的標準化算法(normalization algorithms)進行處理后這種偏差也沒被消除。用于DNA甲基化生物標記分析的樣品通常包括來自腫瘤的高濃度的背景DNA。然而，腫瘤來源的DNA因為通常以非常低的濃度存在而難以檢測，而且能夠被來自健康細胞的DNA大范圍地污染。因此，常常需要對在大量未甲基化的背景DNA中的單拷貝的甲基化DNA具有靈敏檢測能力的方法，以鑒定體液中異常甲基化的腫瘤來源的DNA。其后進行不同的分析步驟的不同類型的預處理的樣品DNA的結合，導致了大量的測定DNA甲基化模式和圖譜的技術。特別地，甲基化分析的方法分為3組基于限制性內切酶的、基于染色質免疫沉淀的(ChIP)或基于親和力的以及亞硫酸氫鹽轉變(基于基因的)。基于限制性內切酶的方法通過結合甲基化敏感的限制性內切酶的使用和用于總甲基化分析的實驗方法(RLGS，DMH等)使用甲基化敏感的限制性內切酶用于小/大范圍的DNA甲基化分析，該方法可以應用于任何未知DNA序列的基因組。然而，需要大量的基因組DNA，使得當回收少量DNA時所述方法不適于樣品的分析。另一方面，基于ChIP的方法對腫瘤中不同甲基化區域的鑒定是有效的，該方法通過使用針對蛋白質的抗體從溶液中沉淀出蛋白質抗原。這些方法是基于蛋白質的，廣泛應用在癌癥研究中。盡管這些優點，基于蛋白質的方法局限在特定位點的甲基(CH3)基團的檢測，在通過限制性內切酶識別序列的頻率獲得的數據上有局限性，當抗體附著后需要額外擴增時變得復雜。MSP因其高分析靈敏度而著稱，然而其能夠被引物設計和PCR循環數影響，因此，存在由假陽性結果引起的風險，當在癌癥早期識別中使用甲基化技術時，據稱該風險是重大問題之一，所以，增加甲基化檢測的特異性代表了在適當的早期識別試驗的發展中重要的一步。本專利技術的專利技術人認識到目前的方法具有高成本的所需手段去檢測熒光，并且通常與標準高容量生產工藝例如CMOS工藝不兼容
技術實現思路
根據本專利技術的第一方面,提供一種離子敏場效應晶體管(ion sensitive fieldeffect transistor) (ISFET)在檢測DNA樣品中甲基化的核苷酸中的應用。根據本專利技術的第二方面，提供一種檢測DNA樣品中甲基化的核苷酸的方法，所述方法包括以下步驟使用區別甲基化的和非甲基化的核苷酸的試劑處理DNA樣品，以提供處理的DNA ；對所述處理的DNA進行擴增；以及 可選擇地，對擴增的DNA進行測序；其中，ISFET監測在擴增和/或測序步驟中的鏈延伸反應期間一個或多個dNTP在DNA鏈上的添加。在擴增和合成測序期間，離子被釋放或消耗。例如，當核苷酸加入到鏈延伸反應中·時氫離子被釋放。可以通過ISFET引起的電信號輸出的改變對這些離子進行檢測。試劑可以是選擇性地結合DNA樣品中甲基化的核苷酸的甲基基團的抗體。然后可以將樣品進行免疫沉淀反應，從而分離結合抗體的DNA片段(S卩，甲基化的片段)和未結合抗體的片段(即，未甲基化的片段)。在用試劑處理前，DNA樣品可以經過一步或多步額外的加工。可以純化DNA，或可以加工DNA以便將DNA鏈破碎為更小的片段。例如，DNA可以經超聲處理(sonicatio本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：克里斯特弗·圖馬佐，M·卡羅佛諾，
申請(專利權)人：DNA電子有限公司，
類型：
國別省市：