本發明專利技術公開了一種施羅氏弧菌多重毒力因子GeXP快速檢測試劑盒和檢測方法。它是先提取施羅氏弧菌的基因組DNA，以其作為模板，用13對多基因PCR引物和一對通用引物進行多重PCR擴增得到多重PCR反應產物，利用GenomeLab?GeXP遺傳分析系統對其進行檢測分析。本發明專利技術針對已知13個施羅氏弧菌毒力基因設計特異性引物，通過單管反應，一次性快速高效的檢測13種基因而得知檢測出樣品中是否含有攜帶毒力基因、具有潛在致病能力的施羅氏弧菌，其檢測覆蓋面廣，可大大提高施羅氏弧菌檢測的準確性。對珊瑚白化現象的防治提供一定的理論基礎，對進一步保護我國珊瑚島嶼，防止其進一步退化具有重要的現實意義。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物
，具體涉及一種專用于可導致珊瑚發生白化現象的病原弧菌一施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)的快速檢測試劑盒和檢測方法。
技術介紹
施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)是一種海洋弧菌,能夠侵染珊瑚，引起珊瑚的細菌性白化。目前，施羅氏弧菌的檢測方法主要是傳統的微生物分類鑒定方法及依賴于PCR技術的檢測方法。傳統的微生物分類和鑒定方法主要是以微生物的形態學和生理生化等特 性作為判斷依據，雖然結果可信度高，但是繁瑣且費時。現階段采用最多的還是分子生物學的方法，其主要依賴于PCR技術對某些特異性的基因進行擴增?？墒沁@些方法都存在一定的缺陷(I)檢測耗時，過程繁瑣；(2)檢測靈敏度低，檢測出病原菌時往往是發病晚期；檢測的目標基因過于單一，容易漏檢由于環境差異導致的同種不同菌株，不能全面反應該種病原菌的潛在致病性。因此，在做病原細菌的檢測時，只有同時檢測盡可能多的特異基因，才能使檢測結果更加具有可靠性，對病原細菌的鑒定更加準確。
技術實現思路
本專利技術的第一個目的是提供一種更為快速準確地評價施羅氏弧菌(Vibrioshilonii)致病性的施羅氏弧菌多重毒力因子GeXP快速檢測試劑盒。本專利技術的施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)多重毒力因子GeXP快速檢測試劑盒，包括PCR反應試劑，多基因PCR引物和GeXP多重擴增反應試劑，其特征在于，所述的多基因PCR引物包括13對多基因PCR引物和一對通用引物，具體如下含有熒光標記的通用引物對序列，可按常規技術將熒光標記加到下述通用引物序列上，所述的熒光標記優選為CY5熒光標記TY-F: 5，-AGGTGACACTATAGAATA-3，TY-B: 5，-GTACGACTCACTATAGGGA-3，為毒力基因sod(NCBI Reference Sequence:NZ_ABCH01000140. I)設計的引物，擴增片段大小約為IlObp sod-F AGGTGACACTATAGAATA CCGTTCATGTAGTCTGGACGsod-R GTACGACTCACTATAGGGA GCAGCGACTCCACTAACAGA為毒力基因fldA(NCBI Reference Sequence:NZ_ABCH0100015l. I)設計的引物，擴增片段大小約為117bp fIdA-F AGGTGACACTATAGAATA ACGTGACATCGTTGAAGCAAfldA-R GTACGACTCACTATAGGGA AGGCCAACGAATTGTGACTC為毒力基因ompUL(GenBank:EU727214. I)設計的引物，擴增片段大小約為124bp ompUL-F AGGTGACACTATAGAATA TTGGTGCGGGTTATCAGCTAompUL-R GTACGACTCACTATAGGGA CGAATACGGTCTGTTAGGTCG為毒力基因toxS(GenBank:EU727211. I)設計的引物，擴增片段大小約為131bp toxS-F AGGTGACACTATAGAATA CGCGGATATATTCACCACCTtoxS-R GTACGACTCACTATAGGGA CAATGAATGGCAATCCAACA為毒力基因Bcp(NCBIReference Sequence:NZ_ABCH01000011. I)設計的引物，擴增片段大小約為138bp Bcp-F AGGTGACACTATAGAATA AACGTTGTGAGCGTCAAGCBcp-R GTACGACTCACTATAGGGA GGCAACACCGTCACACTACA 為毒力基因dnaj (GenBank:ΑΒ263067· I)設計的引物，擴增的片段大小約為145bp dnaJ-F AGGTGACACTATAGAATA ATTCGGTGATATCTTTGGCGdnaJ-R GTACGACTCACTATAGGGA CTCAACGAGCGTTGGAACTT為毒力基因mshA (GenBank:NZ_ABCH01000011. I)設計的引物，擴增片段大小約為152bp mshA-F AGGTGACACTATAGAATA CTGAGCGACGGTTATCAACAmshA-R GTACGACTCACTATAGGGA ATGGTCACGTTAGTTTGCCC為毒力基因z2z3 (GenBank:AF009900. I)設計的引物，擴增片段大小約為159bp z2z3-F AGGTGACACTATAGAATA CTCTCATTGGTTAGCCCTCGz2z3-R GTACGACTCACTATAGGGA ATCATCGGAAGATCAGCGTC為毒力基因fimA(NCBI Reference Sequence:NZ_ABCH01000010. I)設計的引物，擴增片段大小約為166bp fimA-F AGGTGACACTATAGAATA AGCTGTGGTTGATTGGCTCTfimA-R GTACGACTCACTATAGGGA TACCGTTACTGGTGGTGCAA為毒力基因pyrH(GenBank:JN039147. I)設計的引物，擴增片段大小約為173bp pyrH-F AGGTGACACTATAGAATA GACCGTATGGCACAAGAGGTpyrH-R GTACGACTCACTATAGGGA CGCATAGCTAGGCCATTCAT為毒力基因toxRL(GenBank:EU727208. I)設計的引物，擴增片段大小約為180bp toxRL-F AGGTGACACTATAGAATA ACTACGACCATTGCCCAAACtoxRL-R GTACGACTCACTATAGGGA TAGTGTTGAGCGCTCTGTGC為毒力基因rpoA(GenBank:AJ842695. I)設計的引物，擴增片段大小約為187bp rpoA-F AGGTGACACTATAGAATA ACGTGTTGAGCAGCGTACTGrpoA-R GTACGACTCACTATAGGGA AATAGGATCGAACTCCGGCT為毒力基因recA(GenBank:AJ580887. I)設計的引物，擴增片段大小約為195bp recA-F AGGTGACACTATAGAATA ACCATGGACGTTGAAACCATrecA-R GTACGACTCACTATAGGGA GGCATGTTCTGCATCGATAA。本專利技術的第二個目的是提供施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)多重毒力因子GeXP快速檢測方法，其特征在于，包括以下步驟提取施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)的基因組DNA，以其作為模板，用上述13對多基因PCR引物和I對通用引物進行多重PCR擴增得到多重PCR反應產物，利用GenomeLabGeXP遺傳分析系統對多重PCR反應產物進行檢測分析。如果能擴增到相應的PCR產物，則證明該施羅氏弧菌具有相應的毒力基因。本專利技術的施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)多重毒力因子GeXP快速檢測方法是用于非診斷目的的。所述的以施羅氏弧菌(Vibrio shilon本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種施羅氏弧菌(Vibrio？shilonii)多重毒力因子GeXP快速檢測試劑盒，包括PCR反應試劑，多基因PCR引物和GeXP多重擴增反應試劑，其特征在于，所述的多基因PCR引物包括13對多基因PCR引物和一對通用引物，具體為：為毒力基因sod設計的引物sod？F：AGGTGACACTATAGAATA？CCGTTCATGTAGTCTGGACGsod？R：GTACGACTCACTATAGGGA？GCAGCGACTCCACTAACAGA為毒力基因fldA設計的引物fldA？F：AGGTGACACTATAGAATA？ACGTGACATCGTTGAAGCAAfldA？R：GTACGACTCACTATAGGGA？AGGCCAACGAATTGTGACTC為毒力基因ompUL設計的引物ompUL？F：AGGTGACACTATAGAATA？TTGGTGCGGGTTATCAGCTAompUL？R：GTACGACTCACTATAGGGA？CGAATACGGTCTGTTAGGTCG為毒力基因toxS設計的引物toxS？F：AGGTGACACTATAGAATA？CGCGGATATATTCACCACCTtoxS？R：GTACGACTCACTATAGGGA？CAATGAATGGCAATCCAACA為毒力基因Bcp設計的引物Bcp？F：AGGTGACACTATAGAATA？AACGTTGTGAGCGTCAAGCBcp？R：GTACGACTCACTATAGGGA？GGCAACACCGTCACACTACA為毒力基因dnaJ設計的引物dnaJ？F：AGGTGACACTATAGAATA？ATTCGGTGATATCTTTGGCGdnaJ？R：GTACGACTCACTATAGGGA？CTCAACGAGCGTTGGAACTT為毒力基因mshA設計的引物mshA？F：AGGTGACACTATAGAATA？CTGAGCGACGGTTATCAACAmshA？R：GTACGACTCACTATAGGGA？ATGGTCACGTTAGTTTGCCC為毒力基因z2z3設計的引物z2z3？F：AGGTGACACTATAGAATA？CTCTCATTGGTTAGCCCTCGz2z3？R：GTACGACTCACTATAGGGA？ATCATCGGAAGATCAGCGTC為毒力基因fimA設計的引物fimA？F：AGGTGACACTATAGAATA？AGCTGTGGTTGATTGGCTCTfimA？R：GTACGACTCACTATAGGGA？TACCGTTACTGGTGGTGCAA為毒力基因pyrH設計的引物pyrH？F：AGGTGACACTATAGAATA？GACCGTATGGCACAAGAGGTpyrH？R：GTACGACTCACTATAGGGA？CGCATAGCTAGGCCATTCAT為毒力基因toxRL設計的引物toxRL？F：AGGTGACACTATAGAATA？ACTACGACCATTGCCCAAACtoxRL？R：GTACGACTCACTATAGGGA？TAGTGTTGAGCGCTCTGTGC為毒力基因rpoA設計的引物rpoA？F：AGGTGACACTATAGAATA？ACGTGTTGAGCAGCGTACTGrpoA？R：GTACGACTCACTATAGGGA？AATAGGATCGAACTCCGGCT為毒力基因recA設計的引物recA？F：AGGTGACACTATAGAATA？ACCATGGACGTTGAAACCATrecA？R：GTACGACTCACTATAGGGA？GGCATGTTCTGCATCGATAA含有熒光標記的通用引物對序列，可按常規技術將熒光標記加到通用引物序列上：TY？F:5’？AGGTGACACTATAGAATA？3’TY？B:5’？GTACGACTCACTATAGGGA？3’。...
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：陳償，高磊，任春華，胡超群，
申請(專利權)人：中國科學院南海海洋研究所，
類型：發明
國別省市：
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