一種仲丁醇耐受菌株及其篩選方法和應用技術

本發明專利技術涉及一種仲丁醇耐受菌株，名稱為S-2，分類名稱為Lysinibacillus?fusiformis，保藏編號為：CGMCC?No.?6769，保藏日期：2012年11月2日，保藏地址為：北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。本發明專利技術仲丁醇耐受菌株耐受仲丁醇能力強，可以應用于通過代謝工程和基因工程來構建產仲丁醇工程菌株，進而通過微生物發酵法來生產仲丁醇，彌補了目前仍未發現在細菌中存在仲丁醇合成的基因和生物化學方面的證據，以及在自然界的微生物中并沒有發現仲丁醇的合成途徑的缺陷；同時，由于該仲丁醇耐受菌株具有較強的仲丁醇降解能力，因此，也可應用于仲丁醇污染的生物修復。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于微生物
，涉及仲丁醇耐受菌株，尤其是一種仲丁醇耐受菌株及其篩選方法和應用。
技術介紹
仲丁醇有很多用途，可以作為工業溶劑、乳化劑、染料、分散劑、脫水劑、脫漆劑和工業洗滌劑。另外，仲丁醇也可作為提高汽油辛烷值的組分、增塑劑、選礦劑和除草劑。工業上大規模生產仲丁醇主要依靠I- 丁烯和2- 丁烯的水合法來生產。目前仲丁醇的產量達到90萬噸/年，而生產廠家主要集中于歐洲和美國。仲丁醇不能直接用發酵法來生產，生產方法主要是化學法首先，碳源經過一系列 的代謝途徑轉化為2，3-丁二醇；其次，2，3-丁二醇在酶的作用下脫水生成甲乙酮(MEK);最后，甲乙酮通過氫化反應轉化為仲丁醇。據報道，一些乳酸桿菌能夠利用2，3-丁二醇生產仲丁醇。然而，目前仍未發現在細菌中存在仲丁醇合成的基因和生物化學方面的證據，在自然界的微生物中并沒有發現仲丁醇的合成途徑。通過檢索，并未發現與本專利申請相關的專利公開文獻。
技術實現思路
本專利技術的目的在于克服現有技術的不足之處，提供了一種具有較高的仲丁醇耐受能力及較強的仲丁醇降解能力的仲丁醇耐受菌株，該菌株可應用于構建產仲丁醇工程菌株和仲丁醇污染的生物修復；也提供了一種從自然界中富集和分離耐受和降解仲丁醇菌株的篩選方法。本專利技術實現目的的技術方案如下一種仲丁醇耐受菌株，名稱為S-2,分類名稱為Lysinibacillus fusiformis,保藏編號為=CGMCC No. 6769，保藏日期2012年11月2日，保藏地址為北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。如上所述的仲丁醇耐受菌株在構建產仲丁醇工程菌株中的應用。如上所述的仲丁醇耐受菌株在仲丁醇污染的生物修復中的應用。如上所述的仲丁醇耐受菌株的篩選方法，從不同環境樣品中，通過含有不同濃度仲丁醇的富集培養基及耐受培養基進行篩選，并使用菌株的相對生長率作為指標篩選仲丁醇耐受菌株。而且，所述仲丁醇耐受菌株的篩選方法，具體步驟如下⑴從不同生態環境中采集樣品得不同環境樣品；⑵仲丁醇耐受菌株的富集與分離將不同環境樣品混合后使用生理鹽水充分溶解，取上清液置于含有仲丁醇的富集培養基中在搖床上恒溫培養后，吸取部分上清液重新置于新鮮的富集培養基中，如此重復三代；取富集后的菌懸液涂布在含有仲丁醇的固體富集培養基上培養，分離單菌落，得分離菌株；⑶篩選菌株的耐受性分析將分離菌株分別接種到含有仲丁醇的耐受培養基中，以不含仲丁醇的作為對照，培養24 h，用分光光度計在600 nm波長下測每株菌的菌體密度，并計算菌體的相對生長率，相對生長率達到0.29 g/(L*h)以上的菌株即為仲丁醇耐受菌株。 而且，所述不同環境樣品為山東或河北或天津地區的土壤、污泥、沼氣池、臭水溝或海水。而且，所述富集培養基為=KH2PO40. 5 g/L，K2HPO4 0. 5 g/L，FeSO4 7H20 0. 01 g/L，MgSO4 0.2 g/L, NaCl 9g/L，酵母粉 5 g/L，葡萄糖 30 g/L，仲丁醇 5 g/L, pH 7.0，IX IO5Pa、115 °C，滅菌 20 min ；所述耐受培養基為NaCl 10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，質量濃度分別為0.5% 或 1% 或 I. 5% 的仲丁醇，pH 7. 0,1 X IO5 Pa、121 ° C，滅菌 20 min。而且，還包括對篩選所得仲丁醇耐受菌株進行降解性分析。而且，所述對篩選所得仲丁醇耐受菌株進行降解性分析的步驟如下將分離的菌株分別接種到含有不同濃度仲丁醇的LB培養基和基本培養基上，對照組為接入與菌體量相等的生理鹽水，培養24小時后，檢測發酵液及對照組的仲丁醇剩余量，計算得菌株對仲丁醇的降解率。而且，還包括對篩選所得仲丁醇耐受菌株進行菌種鑒定，步驟如下⑴DNA提取方法苯酚-氯仿-異戊醇法抽提；(2) 16S rRNA 引物正向引物=SEQ NO. 1，反向引物=SEQ NO. 2 ；(3) PCR 反應體系10 X Reaction Buffer 5. 0 U L,NTP 2. 5 mmol/L 4. 0 U L,正向引物10 uMol/L I. 0 U L,反向引物10 uMol/L I. Ou L,aq 聚合酶 5 U/ ii L 0.8 U L,DMSO I u L,模版DNA 50 ng/ U L 2. 0 U L,補加重蒸水至50 u L ；(4)卩0 擴增程序94°0 5 min ；94°C 40s ；51°C 2 min ；72°C 3 min 30 個循環;72°C 15 min ；4°C 2 h ；(5)數據處理凝膠純化PCR，使用NCBI Blast分析分離菌株的同源性，并使用Ribosomal Database Project II 軟件 Classifier,對分離的菌株進行分類。本專利技術取得的優點和有益效果是I、本專利技術仲丁醇耐受菌株耐受仲丁醇能力強，在仲丁醇為15 g/L的情況下仍然生長良好，與沒有加仲丁醇的菌相比，其相對生長率分別為0. 58 g/(L -h)，因此可以應用于通過代謝工程和基因工程來構建產仲丁醇工程菌株，進而通過微生物發酵法來生產仲丁醇，彌補了目前仍未發現在細菌中存在仲丁醇合成的基因和生物化學方面的證據，在自然界的微生物中并沒有發現仲丁醇的合成途徑的缺陷；同時，由于該仲丁醇耐受菌株具有較強的仲丁醇降解能力，因此，也可應用于仲丁醇污染的生物修復。2、本專利技術仲丁醇耐受菌株的篩選方法主要利用在富集培養基和選擇性培養基上來富集和分離菌株，通過16S rRNA鑒定菌株，并且通過計算相對生長率和降解率以及分析降解仲丁醇的酶活力來檢測篩選菌對仲丁醇的耐受和降解能力，工藝相對簡單，篩選菌株準確，為微生物發酵法生產仲丁醇提供了新思路。附圖說明圖I為本專利技術篩選方法篩選出的30株耐受菌株的相對生長率圖；其中，A :在0. 5%仲丁醇濃度下30株耐受菌株的相對生長率圖；B :在I. 0%仲丁醇濃度下30株耐受菌株的相對生長率圖；·C :在I. 5%仲丁醇濃度下30株耐受菌株的相對生長率圖；圖2為本專利技術30株分離菌株在不同培養基中對仲丁醇的降解率圖；其中，A :在LB培養基中30株分離菌的降解率圖；B :在基本培養基中30株分離菌的降解率圖；圖3為本專利技術部分分離菌株的全基因組電泳圖；圖4為本專利技術PCR方法擴增部分分離菌株16S rRNA基因片段電泳圖；圖5為本專利技術部分分尚菌株發育樹的構建圖。具體實施例方式下面通過具體實施例對本專利技術作進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本專利技術的保護范圍。需要說明的是從不同地域的不同生態環境中分離得到的微生物，其耐受仲丁醇能力不同，采用相對生長率來分析篩選菌株對仲丁醇的耐受情況，從而篩選出耐受較強的微生物。另外，本專利技術也通過測篩選菌對仲丁醇的降解率來分析菌株對仲丁醇的降解能力。一種仲丁醇耐受菌株，名稱為S-2,分類名稱為Lysinibacillus fusiformis,保藏編號為=CGMCC No. 6769，保藏日期2012年11月2日，保藏地址為北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種仲丁醇耐受菌株，其特征在于：名稱為S?2，分類名稱為Lysinibacillus?fusiformis，保藏編號為：CGMCC?No.?6769，保藏日期：?2012?年?11?月?2?日，保藏地址為：北京市朝陽區大屯路?中國科學院微生物研究所，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。

【技術特征摘要】
1.一種仲丁醇耐受菌株，其特征在于名稱為S-2，分類名稱為Lysinibacillusfusiformis，保藏編號為CGMCC No. 6769，保藏日期2012年11月2日，保藏地址為北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。2.如權利要求I所述的仲丁醇耐受菌株在構建產仲丁醇工程菌株中的應用。3.如權利要求I所述的仲丁醇耐受菌株在仲丁醇污染的生物修復中的應用。4.一種如權利要求I所述的仲丁醇耐受菌株的篩選方法，其特征在于從不同環境樣品中，通過含有不同濃度仲丁醇的富集培養基及耐受培養基進行篩選，并使用菌株的相對生長率作為指標篩選仲丁醇耐受菌株。5.根據權利要求4所述的仲丁醇耐受菌株的篩選方法，其特征在于具體步驟如下 ⑴從不同生態環境中采集樣品得不同環境樣品； ⑵仲丁醇耐受菌株的富集與分離將不同環境樣品混合后使用生理鹽水充分溶解，取上清液置于含有仲丁醇的富集培養基中在搖床上恒溫培養后，吸取部分上清液重新置于新鮮的富集培養基中，如此重復三代；取富集后的菌懸液涂布在含有仲丁醇的固體富集培養基上培養，分離單菌落，得分離菌株； ⑶篩選菌株的耐受性分析將分離菌株分別接種到含有仲丁醇的耐受培養基中，以不含仲丁醇的作為對照，培養24 h，用分光光度計在600 nm波長下測每株菌的菌體密度，并計算菌體的相對生長率，相對生長率達到0.29 g/(L*h)以上的菌株即為仲丁醇耐受菌株。6.根據權利要求4或5所述的仲丁醇耐受菌株的篩選方法，其特征在于所述不同環境樣品為山東或河北或天津地區的土壤、污泥、沼氣池、臭水溝或海水。7.根據權利要求4或5所述的仲丁醇耐受菌株的篩選方法，其特征在于所述富集培養基為KH2PO4 0.5 g/L, K2HPO4 0.5 g/L，FeSO4 7H20 0. 01 g/L, MgSO4 0.2 g/L, NaCl 9g/L，酵母粉 5 g/L，葡萄糖 30 g/L，仲丁醇 5 g/L, pH 7.0，I ...

【專利技術屬性】
技術研發人員：楊洪江，石禮濤，
申請(專利權)人：天津科技大學，
類型：發明
國別省市：