中慢生根瘤菌KDRM495及其應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一個(gè)從刺槐根瘤中分離的、有ACC脫氨酶能高效結(jié)瘤并促進(jìn)刺槐生長的中慢生根瘤菌KDRM495及其應(yīng)用。該中慢生根瘤菌KDRM495菌株已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC?NO：M2012333。本發(fā)明專利技術(shù)所述的中慢生根瘤菌KDRM495有ACC脫氨酶，能將ACC分解成α-酮丁酸和NH3，降低植物細(xì)胞合成乙烯的水平，減輕乙烯對(duì)根瘤菌侵染的抑制作用，提高根瘤菌與刺槐的結(jié)瘤率和共生固氮的水平，為刺槐在不施肥的貧瘠荒地上生長提供高水平的氮素，促進(jìn)刺槐苗生長，增加刺槐成材的生物量，從而用低成本的接種投入讓刺槐成材高產(chǎn)，在刺槐育苗造林上發(fā)揮作用。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于應(yīng)用微生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一個(gè)從刺槐根瘤中分離的、有ACC脫氨酶能高效結(jié)瘤并促進(jìn)刺槐生長的中慢生根瘤菌KDRM495及其應(yīng)用。該菌株已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號(hào)為CCTCC NO M 2012333，菌株名為中慢生根瘤菌KDRM495。
技術(shù)介紹
自然界中有些原核微生物能合成固氮酶，在常溫常壓下，將空氣中的N2還原成NH3。由固氮微生物固定的氮素約占地表化合態(tài)氮的65% - 70%，其中以根瘤菌與豆科植物共生體系固氮能力最強(qiáng)，占生物固氮量的65%以上。利用根瘤菌與豆科植物共生固氮提高土壤肥力和農(nóng)作物產(chǎn)量是世界農(nóng)業(yè)的經(jīng)典經(jīng)驗(yàn)。如用豆科植物作綠肥，讓豆科與非豆科作物輪作、間作和套作。通過接種根瘤菌提高豆科作物的共生固氮效率和產(chǎn)量及土壤肥力已有100多年歷史，廣泛為各農(nóng)業(yè)大國所用，是當(dāng)今發(fā)展可持續(xù)農(nóng)業(yè)的重要措施之一。20世紀(jì)80年代以來，我國糧食作物的種植面積不斷擴(kuò)大，豆科作物和豆科綠肥的種植面積不斷減少，化肥尤其是氮肥用量不斷增加。由于高水平化合態(tài)氮阻遏根瘤菌結(jié)瘤固氮，接種根瘤菌的結(jié)瘤固氮效應(yīng)在施用大量氮肥的農(nóng)田里急劇下降，根瘤菌接種事業(yè)的發(fā)展隨之被遏制。進(jìn)入21世紀(jì)，中國實(shí)施西部大開發(fā)戰(zhàn)略和退耕還林還草工程，為擴(kuò)大豆科樹種、牧草的種植面積和加強(qiáng)與之相匹配的根瘤菌接種技術(shù)應(yīng)用提供了契機(jī)。刺槐(TPoAiflia pseudoacacia L.)又稱洋槐,是落葉喬木,高10 - 25米,木質(zhì)堅(jiān)硬，有彈性，抗磨損，是良好礦柱、枕木、建筑用材。刺槐原產(chǎn)美國東部，引種入歐洲后，于十九世紀(jì)末再從歐洲引入中國。刺槐生長快，分布越來越廣，一方面得益于刺槐適應(yīng)性強(qiáng)，能在酸性土、中性土和含鹽量0.3%以下的鹽堿土中生長，有一定的耐旱能力；另一方面刺槐是豆科植物，可以與根瘤菌共生固氮而獲取生長所必需的氮素，從而適于在貧瘠的土地生長。種植刺槐的生態(tài)效應(yīng)，如保持水土、改良土壤等，也非常顯著。因此，刺槐成為全世界最重要的速生造林先鋒樹種之一，也是我國退耕還林工程的先鋒樹種。隨著全球石油、煤炭和天然氣等礦物能源的日益枯竭，開發(fā)利用可再生的生物質(zhì)能源以取代礦物能源越來越為世界各國政府所關(guān)注。目前，中國經(jīng)濟(jì)快速增長，礦物能源消耗量急劇增長，能源短缺問題十分突出，生物質(zhì)能源等可再生能源的開發(fā)和利用已成為實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。生物質(zhì)能源的開發(fā)和利用的基點(diǎn)在于原料生產(chǎn)，原料成本占總成本的60% - 80%，原料成本決定產(chǎn)品的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力和利潤。林木是生物質(zhì)能源的重要原料。刺槐憑借其熱值高，生長速度快和耐瘠抗逆等特點(diǎn)，成為重要的生物質(zhì)能源樹種。在貧瘠荒地上，用少施肥、低成本的投入產(chǎn)出高的成材生物量是目前我國刺槐能源林生產(chǎn)的瓶頸問題。用高效結(jié)瘤固氮的根瘤菌接種刺槐苗，通過共生固氮使樹苗在貧瘠的土地上獲得氮素成材，可能提高刺槐造林效率和降低原料成本。目前，一方面，在技術(shù)上，現(xiàn)代刺槐造林通過大規(guī)模苗圃育苗提高造林效率，為刺槐苗人工接種根瘤菌創(chuàng)造了便利條件。另一方面，限于技術(shù)和管理上的制約，我國的大規(guī)模造林還沒有向林業(yè)發(fā)達(dá)國家那樣實(shí)施以氮素為主的大規(guī)模施肥，但不施肥反而為刺槐與根瘤菌的共生固氮?jiǎng)?chuàng)造了沒有氮阻遏的條件，有利于提高共生固氮的效率。刺槐適應(yīng)貧瘠土壤能力強(qiáng)的一個(gè)因素是它能與多個(gè)屬種的遺傳多樣的根瘤菌共生固氮。已發(fā)現(xiàn)能與刺槐結(jié)瘤的主要是中慢生根瘤菌屬的根瘤菌,還有中華根瘤菌屬(Sinorhizobia )、根瘤菌屬(/Sizobium )和慢生根瘤菌屬iBradyrhizobium )等屬的根瘤菌。根瘤菌與刺槐結(jié)瘤固氮的能力高低不一，利用接種根瘤菌促進(jìn)刺槐生長需要選擇高效的根瘤菌菌株。通常篩選優(yōu)良根瘤菌菌株是通過從多個(gè)大且飽滿的刺槐根瘤中分離多個(gè)根瘤菌菌株，逐一接種刺槐苗，培養(yǎng)2個(gè)月或更長時(shí)間后，檢測(cè)刺槐苗根部的結(jié)瘤數(shù)和苗的生物量；而要從數(shù)量較多的菌株中篩選出高效結(jié)瘤固氮的根瘤菌菌株要靠碰運(yùn)氣，篩選過程費(fèi)時(shí)費(fèi)力。根瘤菌侵染豆科植物的根會(huì)引發(fā)植物產(chǎn)生植物激素乙烯及合成乙烯的前體I-氨基環(huán)丙烷-I羧酸(ACC)，而乙烯會(huì)抑制根瘤菌結(jié)瘤和固氮。近年來的研究發(fā)現(xiàn)有些根瘤菌有ACC脫氨酶。ACC脫氨酶能催化ACC脫氨基反應(yīng)，生成a-酮丁酸和NH3。根瘤菌侵染根時(shí)，根細(xì)胞合成ACC并釋放部分ACC到細(xì)胞外。有ACC脫氨酶的根瘤菌能吸收并降解植物細(xì)胞釋放的ACC，使根細(xì)胞中的ACC不斷釋放而減少，根細(xì)胞合成乙烯的量就相應(yīng)減少，從而降低了乙烯對(duì)根瘤菌侵染結(jié)瘤的抑制作用。如果把根瘤菌的ACC脫氨酶結(jié)構(gòu)基因CacoSO敲除，根瘤菌的結(jié)瘤能力會(huì)顯著降低(Uchiumi等，Journal ofBacteriology 2004, 186:2439-2448);相反，如果向原本沒有act/51的根瘤菌導(dǎo)入acoS1,那根瘤菌工程菌的結(jié)瘤率、占瘤率和固氮效率顯著高于野生型菌株(Ma等，Applied andEnvironmental Microbiology 2004, 70:5891-5897 ;Conforte 等，Journal of Generaland Applied Microbiology 2010, 56:331-338; Tittabutr 等，Systematic and AppliedMicrobiology 2008, 31:141-150; Nascimento Letters in Applied Microbiology2012，55:15-21)。這表明有ACC脫氨酶的根瘤菌有強(qiáng)的侵染力，能高效結(jié)瘤。根瘤菌調(diào)控ACC脫氨酶的機(jī)制比較復(fù)雜。研究已發(fā)現(xiàn)很多有ac必的中慢生根瘤菌屬的根瘤菌在自由培養(yǎng)狀態(tài)下不表達(dá)沒有ACC脫氨酶活性，但在根瘤中會(huì)高水平地表達(dá)acoU，發(fā)揮ACC脫氨酶的作用(Ma 等，Antonie van Leeuwenhoek 2003, 83:285-291 ;Nukui 等，Applied andEnvironmental Microbiology 2006, 72:4964-4969 ;Nascimento 等，F(xiàn)EMS MicrobiologyLetters 2012, 336:26-37)。因此，篩選有ACC脫氨酶的根瘤菌時(shí)，如果檢測(cè)自由培養(yǎng)狀態(tài)下根瘤菌的ACC脫氨酶活性，對(duì)很多根瘤菌尤其是中慢生根瘤菌會(huì)失效，而用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)根瘤菌有無基因會(huì)更有效。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)所要解決的技術(shù)問題在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一個(gè)從刺槐根瘤中分離的、有ACC脫氨酶能高效結(jié)瘤并促進(jìn)刺槐生長的中慢生根瘤菌KDRM495及其應(yīng)用。本專利技術(shù)實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的所采用的技術(shù)方案如下 先用常規(guī)方法從刺槐根瘤中分離和純化根瘤菌，再從根瘤菌基因組中擴(kuò)增基因，對(duì)擴(kuò)增出的目標(biāo)片段測(cè)序確定菌株有無基因和ACC脫氨酶，再用有ACC脫氨酶的根瘤菌菌株接種刺槐幼苗，在接種3個(gè)月后檢測(cè)結(jié)瘤數(shù)、植株的株高、地徑和干重，選出能高效結(jié)瘤、顯著促進(jìn)刺槐苗生長和提高植株生物量的根瘤菌菌株用于育苗造林。另一方面，擴(kuò)增有ACC脫氨酶根瘤菌的16S rRNA基因并測(cè)序，通過序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析16S rRNA基因序列確定菌株的分類歸屬；同時(shí)對(duì)篩選出的有ACC脫氨酶的根瘤菌與同屬根瘤菌中已知有ACC脫氨酶菌株的aco本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
中慢生根瘤菌KDRM495，其特征在于：它已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC?NO：M?2012333。

【技術(shù)特征摘要】
1.中慢生根瘤菌KDRM495，其特征在于它已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為 CCTCC ...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李萬里，李江川，張繼泰，陳衛(wèi)文，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中盈長江國際新能源投資有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：