本發明專利技術涉及一種防除連作番茄青枯病的微生物植物疫苗，屬于農業集約化生產技術。本發明專利技術從番健康茄根際分離到了一株青枯菌同屬細菌皮氏羅爾斯通氏菌(Ralstoniapickettii)NJQL-A6。該菌對青枯病病原菌茄科羅爾斯通氏菌(Ralstonia?solanacearum)平板抑制作用弱，但在番茄根際和植物內部定殖能力強，能抑制茄科羅爾斯通氏菌對番茄植株的侵染。試驗表明，這種疫苗澆灌施用到土壤后能迅速繁殖，在土壤中形成優勢群，在發病嚴重的番茄青枯病土壤中生防效率達70％以上。對于根部已被青枯菌侵染的番茄植株，通過地上部接種該生防菌能有效控制病害的進一步發展。
【技術實現步驟摘要】
一種能防治番茄青枯病的微生物植物疫苗
本專利技術一種能防除連作番茄青枯病的微生物植物疫苗，屬于農業集約化生產技術，專用于克服和消除連作番茄青枯病問題。二、
技術介紹
番爺青枯病是由爺科羅爾斯通氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的細菌性維管束土傳病害。1906年美國Simth學者首次發現并報道這一病害，至今全世界除南極洲外， 其他國家和地區均有青枯菌的存在。羅爾斯通菌被分為五個生理小種和6個生化小種。各小種對番茄均有一定的致病能力，其中生理小種I對番茄的致病力最強。在我國，番茄青枯病主要發生在溫暖濕潤的南方，隨著氣候變暖和高效農業發展，青枯病逐漸向我國北方發展。青枯菌能通過土壤、流水(灌溉等)、種子等方式傳播，對環境有很強的適應能力。土壤中存在青枯菌后，初期由于病菌數量少，植株生長受到限制，矮小，果實小，農民往往認為是養分問題而加大氮肥投入，導致土壤中微生物群落進一步失衡，番茄連作3季以上，病原菌在根際成優勢，就能侵染番茄。在高溫高濕的條件下，病害發展迅速，發病嚴重的田塊發病率達100%，造成絕收。目前南方很多蔬菜基地不再適合種植番茄，對我國番茄市場的發展影響很大。目前沒有防治番茄青枯病的有效手段，利用根際微生物防治病害是綜合防治土傳病害的重要措施之一。生防菌的根際定殖和內生能力是影響其防效的關鍵因子。生物防治技術滿足現代農業對環境保護，食品安全等的要求，是實現農業可持續農業發展的有效方法之一。三、
技術實現思路
I.技術問題本專利技術的目的在于開發一種能防治連作番茄青枯病的微生物植物疫苗，克服或消除連作番茄作物青枯病效率達到70%以上，減少或完全替代農藥的使用，確保集約化農業的順利發展。2.技術方案防除連作番茄青枯病的生防菌NJQL-A6，該微生物屬于皮氏羅爾斯通菌 (Ralstonia pickettii), 2012年9月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC NO. 6628，主要生物學特性為革蘭氏染色陽性G-，細胞形狀為短桿狀，O. 5 O. 6 X I. 5 3. O μ m，單一極生鞭毛，不形成芽孢，嚴格好氧生長，在平板上不產色素，氧化酶、接觸酶反應陽性，硝酸還原酶陽性，淀粉水解陰性，明膠水解陰性，精氨酸雙水解酶陰性，卵黃反應陰性，脂肪酶，磷酸酶，脯氨酸氨肽酶等呈陽性。發酵丙三醇、 D-木糖、L-阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、果糖；己二酸，L-色氨酸，L-絡氨酸、Y -氨基丁酸、 L-天冬氨酸鹽、L-纈氨酸、L-蘇氨酸、甘氨酸和蘇氨酸、L-絲氨酸、能利用核酸鹽、L-谷氨酸鹽、葡萄糖酸鹽,奎酸鹽,蘋果酸鹽,檸檬酸鹽，乙酸鹽、丙酸鹽,丁酸鹽、馬尿酸鹽等。用生防菌NJQL-A6所生產的防除連作番茄青枯病微生物植物疫苗，該疫苗中含有I X IO8個/ml以上的生防菌NJQL-A6。所述的防除連作番茄青枯病微生物植物疫苗，其生產方法包括選用生防菌NJQL-A6，接種到 KB(20g 蛋白胨，IOmL 甘油，1.5g MgSO4 · 7H20,1. 5g FeS047H20，蒸餾水1L，pH 7. 2，121°C滅菌20min)或CPG (IOg蛋白胨，Ig水解絡蛋白，5g葡萄糖，18g瓊脂，IL蒸餾水，pH 7. 2，115°C，高壓滅菌30min)培養液，進行液體發酵生產，其發酵生產的條件為pH生長范圍6-8，培養溫度范圍25 37°C，攪拌速度為170 300轉/ 分鐘，發酵液含菌量彡I X IOltl個/ml。所述微生物植物疫苗可專用于防除連作番茄青枯病。3.有益效果本專利技術一株防控連作番茄青枯病的微生物植物疫苗，具有如下優點I)生防菌NJQL-A6是青枯菌同屬菌，其生活習性與青枯菌類似(但對植物不致病)，與青枯菌競爭營養物質和生存位點的能力非常強。該菌施入土壤后能在番茄根際形成優勢群，起到保護植物根系的作用，抵御病菌的侵染。2)該菌株內生性能好，在番茄莖基部穩定大量存活。針對已經被青枯菌感染的植株，通過地上部接種，該生防菌可以快速在植物體內擴散大量定殖，抵御病菌進一步侵染。3)本專利技術田間施用方便，用量少。在育苗期傷根澆灌該生防菌懸液，可使菌株在苗期在根部和根內定殖，在育苗期間即完成疫苗施用。4)本植物疫苗生產原料成本較低，生產工藝簡便，固定資產投入少，生產過程中耗電耗水極少，因此產品價位適中而針對性強，企業每生產I噸微生物植物疫苗的所有成本不超過2000元，而目前市場上一般的特效專用為菌劑價格在20000元/噸以上，而且非常緊缺，因此本產品具有強大的社會、環境和經濟生命力。5)試驗結果表明，在連作番茄的土壤上施用本產品后，能顯著降低番茄青枯病的發病率，生物防治率達80%以上。四附圖說明圖I施用不同濃度疫苗NJQL-A6對番茄青枯病發病率和生防率的影響圖2灌根和莖部注射法施用疫苗NJQL-A6處理青枯病的發病率圖3無菌水和疫苗NJQL-A6處理田間番茄青枯病發病率(A)和番茄莖基部、接種點和葉柄處青枯菌的數量(B)五具體實施方式(一)菌株的分離和鑒定防除連作番茄青枯病的植物疫苗NJQL-A6，分離來自于連作番茄青枯病發病的田塊健康番茄植株根際土壤。通過采集已經發生連作障礙并出現番茄青枯病病癥的植株和周圍土壤，樣品低溫保存，采用M-SMSA青枯病選擇性培養基獲得病原菌株和大量供試生防菌(疑似非致病性青枯菌)，分別利用CPG，TZC和M-SMSA培養基通過平板對峙實驗初篩， 根際和莖基部定殖能力實驗復篩，最后通過盆栽試驗確定高效生防菌株，鑒定屬種，菌種凍干-20°C保存。該菌株NJQL-A6屬于皮氏羅爾斯通氏菌(Ralstonia pickettii),主要生物學特4性為革蘭氏染色陽性G-，細胞形狀為短桿狀，O. 5 O. 6 X I. 5 3. O μ m，單一極生鞭毛，不形成芽孢，嚴格好氧生長，在平板上不產色素，氧化酶、接觸酶反應陽性，硝酸還原酶陽性， 淀粉水解陰性，明膠水解陰性，精氨酸雙水解酶陰性，卵黃反應陰性，脂肪酶，磷酸酶，脯氨酸氨肽酶等呈陽性。發酵丙三醇、D-木糖、L-阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、果糖；己二酸，L-色氨酸，L-絡氨酸、Y -氨基丁酸、L-天冬氨酸鹽、L-纈氨酸、L-蘇氨酸、甘氨酸和蘇氨酸、 L-絲氨酸、能利用核酸鹽、L-谷氨酸鹽、葡萄糖酸鹽，奎酸鹽，蘋果酸鹽，檸檬酸鹽，乙酸鹽、 丙酸鹽，丁酸鹽、馬尿酸鹽等。( 二)疫苗生產選用生防菌NJQL-A6，接種到 KB(20g 蛋白胨，IOmL 甘油，1.5g MgSO4 · 7H20,1. 5g FeSO4 ·7Η20，蒸餾水1L，pH 7· 2，121°C滅菌20min)或CPG (IOg蛋白胨，Ig水解絡蛋白，5g葡萄糖，18g瓊脂，IL蒸餾水，pH 7. 2，115°C，高壓滅菌30min)培養液，進行液體發酵生產，其發酵生產的條件為pH生長范圍6-8，培養溫度范圍25 37°C，攪拌速度為170 300轉/ 分鐘，發酵液含菌量彡I X IOltl個/ml。(三)溫室防效試驗I、不同施用濃度在番茄三葉期采用灌根法比較施用不同濃度疫苗NJQL-A6防控番茄青枯病的效果。試驗設置三個處理，即疫苗R. pickettii NJQL-A6與病原菌R. solanacearu本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種防除連作番茄青枯病的生防菌，該菌株NJQL?A6屬于皮氏羅爾斯通氏菌(Ralstonia?pickettii)，2012年9月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC?NO.6628，主要生物學特性為革蘭氏染色陰性G?，細胞形狀為短桿狀，0.5～0.6×1.5～3.0μm，單一極生鞭毛，不形成芽孢，嚴格好氧生長，在平板上不產色素，氧化酶、接觸酶反應陽性，硝酸還原酶陽性，淀粉水解陰性，明膠水解陰性，精氨酸雙水解酶陰性，卵黃反應陰性，脂肪酶，磷酸酶，脯氨酸氨肽酶等呈陽性。發酵丙三醇、D?木糖、L?阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、果糖；己二酸，L?色氨酸，L?絡氨酸、γ?氨基丁酸、L?天冬氨酸鹽、L?纈氨酸、L?蘇氨酸、甘氨酸和蘇氨酸、L?絲氨酸、能利用核酸鹽、L?谷氨酸鹽、葡萄糖酸鹽，奎酸鹽，蘋果酸鹽，檸檬酸鹽，乙酸鹽、丙酸鹽，丁酸鹽、馬尿酸鹽等。
【技術特征摘要】
1.一種防除連作番茄青枯病的生防菌，該菌株NJQL-A6屬于皮氏羅爾斯通氏菌(Ralstonia pickettii), 2012年9月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC NO. 6628，主要生物學特性為革蘭氏染色陰性G-，細胞形狀為短桿狀，O. 5 O. 6 X I. 5 3. O μ m，單一極生鞭毛，不形成芽孢，嚴格好氧生長，在平板上不產色素，氧化酶、接觸酶反應陽性，硝酸還原酶陽性，淀粉水解陰性，明膠水解陰性，精氨酸雙水解酶陰性，卵黃反應陰性，脂肪酶，磷酸酶，脯氨酸氨肽酶等呈陽性。發酵丙三醇、D-木糖、L-阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、果糖；己二酸，L-色氨酸，L-絡氨酸、Y -氨基丁酸、L-天冬氨酸鹽、L-纈氨酸、L-蘇氨酸、甘氨酸和蘇氨酸、L-絲氨酸、能利用核酸鹽、L-谷氨酸鹽、葡萄糖酸鹽,奎酸鹽,蘋果酸鹽,檸檬酸鹽，乙酸鹽、丙酸鹽,丁酸鹽、馬尿酸鹽等。2.用權利要求I所述生防菌NJQL-A6所生產的防除連作番茄青枯...
【專利技術屬性】
技術研發人員：沈其榮，韋中，徐陽春，黃建鳳，楊興明，
申請(專利權)人：南京農業大學，
類型：發明
國別省市：
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