本發明專利技術涉及一個從刺槐根瘤中分離的、有ACC脫氨酶能高效結瘤并促進刺槐生長的中慢生根瘤菌KDRM319及其應用。該中慢生根瘤菌KDRM319菌株已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC?M2012332。本發明專利技術所述的中慢生根瘤菌KDRM319有ACC脫氨酶，能將ACC分解成α-酮丁酸和NH3，降低植物細胞合成乙烯的水平，減輕乙烯對根瘤菌侵染的抑制作用，提高根瘤菌與刺槐的結瘤率和共生固氮的水平，為刺槐在不施肥的貧瘠荒地上生長提供高水平的氮素，促進刺槐苗生長，增加刺槐成材的生物量，從而用低成本的接種投入讓刺槐成材高產，在刺槐育苗造林上發揮作用。
【技術實現步驟摘要】
中慢生根瘤菌KDRM319及其應用
本專利技術屬于應用微生物學領域，具體涉及一個從刺槐根瘤中分離的、有ACC脫氨酶能高效結瘤并促進刺槐生長的中慢生根瘤菌KDRM319及其應用。該菌株已保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏號為CCTCC NO M 2012332，菌株名為中慢生根瘤菌 KDRM319。
技術介紹
自然界中有些原核微生物能合成固氮酶，在常溫常壓下，將空氣中的N2還原成 NH3。由固氮微生物固定的氮素約占地表化合態氮的65% - 70%，其中以根瘤菌與豆科植物共生體系固氮能力最強，占生物固氮量的65%以上。利用根瘤菌與豆科植物共生固氮提高土壤肥力和農作物產量是世界農業的經典經驗。如用豆科植物作綠肥，讓豆科與非豆科作物輪作、間作和套作。通過接種根瘤菌提高豆科作物的共生固氮效率和產量及土壤肥力已有100多年歷史，廣泛為各農業大國所用， 是當今發展可持續農業的重要措施之一。20世紀80年代以來，我國糧食作物的種植面積不斷擴大，豆科作物和豆科綠肥的種植面積不斷減少，化肥尤其是氮肥用量不斷增加。由于高水平化合態氮阻遏根瘤菌結瘤固氮，接種根瘤菌的結瘤固氮效應在施用大量氮肥的農田里急劇下降，根瘤菌接種事業的發展隨之被遏制。進入21世紀，中國實施西部大開發戰略和退耕還林還草工程，為擴大豆科樹種、牧草的種植面積和加強與之相匹配的根瘤菌接種技術應用提供了契機。刺槐(TPoAiflia pseudoacacia L.)又稱洋槐,是落葉喬木,高10 - 25米,木質堅硬，有彈性，抗磨損，是良好礦柱、枕木、建筑用材。刺槐原產美國東部，引種入歐洲后，于十九世紀末再從歐洲引入中國。刺槐生長快，分布越來越廣，一方面得益于刺槐適應性強， 能在酸性土、中性土和含鹽量O. 3%以下的鹽堿土中生長，有一定的耐旱能力；另一方面刺槐是豆科植物，可以與根瘤菌共生固氮而獲取生長所必需的氮素，從而適于在貧瘠的土地生長。種植刺槐的生態效應，如保持水土、改良土壤等，也非常顯著。因此，刺槐成為全世界最重要的速生造林先鋒樹種之一，也是我國退耕還林工程的先鋒樹種。隨著全球石油、煤炭和天然氣等礦物能源的日益枯竭，開發利用可再生的生物質能源以取代礦物能源越來越為世界各國政府所關注。目前，中國經濟快速增長，礦物能源消耗量急劇增長，能源短缺問題十分突出，生物質能源等可再生能源的開發和利用已成為實現可持續發展的關鍵。生物質能源的開發和利用的基點在于原料生產，原料成本占總成本的60% - 80%，原料成本決定產品的市場競爭力和利潤。林木是生物質能源的重要原料。刺槐憑借其熱值高，生長速度快和耐瘠抗逆等特點，成為重要的生物質能源樹種。在貧瘠荒地上，用少施肥、低成本的投入產出高的成材生物量是目前我國刺槐能源林生產的瓶頸問題。用高效結瘤固氮的根瘤菌接種刺槐苗，通過共生固氮使樹苗在貧瘠的土地上獲得氮素成材，可能提高刺槐造林效率和降低原料成本。 目前，一方面，在技術上，現代刺槐造林通過大規模苗圃育苗提高造林效率，為刺槐苗人工接種根瘤菌創造了便利條件。另一方面，限于技術和管理上的制約，我國的大規模造林還沒有向林業發達國家那樣實施以氮素為主的大規模施肥，但不施肥反而為刺槐與根瘤菌的共生固氮創造了沒有氮阻遏的條件，有利于提高共生固氮的效率。刺槐適應貧瘠土壤能力強的一個因素是它能與多個屬種的遺傳多樣的根瘤菌共生固氮。已發現能與刺槐結瘤的主要是中慢生根瘤菌屬的根瘤菌,還有中華根瘤菌屬(Sinorhizobia )、根瘤菌屬(/Sizobium )和慢生根瘤菌屬iBradyrhizobium ) 等屬的根瘤菌。根瘤菌與刺槐結瘤固氮的能力高低不一，利用接種根瘤菌促進刺槐生長需要選擇高效的根瘤菌菌株。通常篩選優良根瘤菌菌株是通過從多個大且飽滿的刺槐根瘤中分離多個根瘤菌菌株，逐一接種刺槐苗，培養2個月或更長時間后，檢測刺槐苗根部的結瘤數和苗的生物量；而要從數量較多的菌株中篩選出高效結瘤固氮的根瘤菌菌株要靠碰運氣，篩選過程費時費力。根瘤菌侵染豆科植物的根會引發植物產生植物激素乙烯及合成乙烯的前體 I-氨基環丙烷-I羧酸(ACC)，而乙烯會抑制根瘤菌結瘤和固氮。近年來的研究發現有些根瘤菌有ACC脫氨酶。ACC脫氨酶能催化ACC脫氨基反應，生成α-酮丁酸和NH3。根瘤菌侵染根時，根細胞合成ACC并釋放部分ACC到細胞外。有ACC脫氨酶的根瘤菌能吸收并降解植物細胞釋放的ACC，使根細胞中的ACC不斷釋放而減少，根細胞合成乙烯的量就相應減少，從而降低了乙烯對根瘤菌侵染結瘤的抑制作用。如果把根瘤菌的ACC 脫氨酶結構基因CacoSO敲除，根瘤菌的結瘤能力會顯著降低(Uchiumi等，Journal of Bacteriology 2004, 186:2439-2448);相反，如果向原本沒有acoS1的根瘤菌導入acoU, 那根瘤菌工程菌的結瘤率、占瘤率和固氮效率顯著高于野生型菌株(Ma等，Applied and Environmental Microbiology 2004, 70:5891-5897 ;Conforte 等，Journal of General and Applied Microbiology 2010, 56:331-338; Tittabutr 等，Systematic and Applied Microbiology 2008, 31:141-150; Nascimento Letters in Applied Microbiology 2012，55:15-21)。這表明有ACC脫氨酶的根瘤菌有強的侵染力，能高效結瘤。根瘤菌調控 ACC脫氨酶的機制比較復雜。研究已發現很多有^必的中慢生根瘤菌屬的根瘤菌在自由培養狀態下不表達aci/S，沒有ACC脫氨酶活性，但在根瘤中會高水平地表達aci/S，發揮ACC脫氨酶的作用(Ma 等，Antonie van Leeuwenhoek 2003, 83:285-291 ;Nukui 等，Applied and Environmental Microbiology 2006, 72:4964-4969 ;Nascimento 等，FEMS Microbiology Letters 2012, 336:26-37)。因此，篩選有ACC脫氨酶的根瘤菌時，如果檢測自由培養狀態下根瘤菌的ACC脫氨酶活性，對很多根瘤菌尤其是中慢生根瘤菌會失效，而用聚合酶鏈式反應(PCR)檢測根瘤菌有無aci/S基因會更有效。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題在于針對現有技術的不足而提供一個從刺槐根瘤中分離的、有ACC脫氨酶能高效結瘤并促進刺槐生長的中慢生根瘤菌KDRM319及其應用。本專利技術實現上述技術目的所采用的技術方案如下先用常規方法從刺槐根瘤中分離和純化根瘤菌，再從根瘤菌基因組中擴增基因， 對擴增出的目標片段測序確定菌株有無基因和ACC脫氨酶，再用有ACC脫氨酶的根瘤菌菌株接種刺槐幼苗，在接種3個月后檢測結瘤數、植株的株高、地徑和干重，選出能高效結瘤、顯著促進刺槐苗生長和提高植株生物量的根瘤菌菌株用于育苗造林。另一方面，擴增有ACC脫氨酶根瘤菌的16S rRNA基因并測序，通過序列比對和系統發育分析16S rRNA基因序列確定菌株的分類歸本文檔來自技高網...
【技術保護點】
中慢生根瘤菌KDRM319，其特征在于：它已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC?NO：M?2012332。
【技術特征摘要】
1.中慢生根瘤菌KDRM319，其特征在于它已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為 CCTCC ...
【專利技術屬性】
技術研發人員：李萬里，李江川，張繼泰，郭新安，
申請(專利權)人：中盈長江國際新能源投資有限公司，
類型：發明
國別省市：
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