本發明專利技術涉及一種正丁醇耐受菌株，名稱為YY-23，分類名稱為Pseudomonas?stutzeri，保藏編號為：CGMCC?No.6771，保藏日期：2012年11月2日，保藏地址為：北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。本發明專利技術分離的正丁醇耐受菌株，可以作為宿主菌，異源表達正丁醇合成途徑的關鍵酶基因，可得到正丁醇產量較高的重組菌株，為正丁醇重組菌的構建擴寬了思路。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物
，涉及正丁醇耐受微生物，尤其是。
技術介紹
正丁醇是重要的精細化工原料，主要用于鄰苯二甲酸二丁酯DBP和丙烯酸丁酯BA等脂肪族二元酸脂類及磷酸酯類的生產。更重要的是，由于正丁醇能值高、可混合性高、辛烷值高和揮發性低等優勢，所以正丁醇更是良好的生物燃料。研究表明正丁醇燃燒所釋放的能量是同等體積的乙醇的兩倍。隨著石油資源的日益匱乏和溫室效應的日益惡化，生物法生產正丁醇越來越受到人們的關注。 正丁醇可通過微生物發酵法生產，一般采用丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)及相關變種，在厭氧條件下利用淀粉或糖份發酵生成丙酮、丁醇和少量酒精等有機溶劑，故稱ABE發酵。目前生產菌株主要是專性厭氧的梭狀芽孢桿菌，包括 Clostridium acetobutylicum、C. beijerinckii、C. saccharoprbutylacetonicum 和C. saccharobutylicum0ABE發酵法生產正丁醇有很長的歷史，但存在溶劑濃度低、溶劑產量低、丁醇毒性大以及產品比例不合理等因素，導致生物法生產正丁醇難以和化學合成法相競爭的主要因素。為了提高微生物發酵生產正丁醇的能力，在選育菌種方面，人們用了不同的方法，包括合成生物學、基因突變、基因工程和代謝工程、細胞固定化以及發酵過程中移除正丁醇等策略。由于ABE發酵時對設備要求較高且傳統菌株生長緩慢，所以人們把正丁醇的合成路徑克隆到不同的微生物中形成異源表達，如在大腸埃希氏菌、惡臭假單胞菌、枯草芽孢桿菌和短乳酸菌的表達。這些微生物對正丁醇有較高耐受能力，相比梭狀芽孢桿菌，也有較高生長速率。目前已有梭菌丁醇合成基因在不同受體菌進行表達的文獻報道，Inui等在大腸桿菌中表達梭菌丁醇代謝途徑相關基因，Stee等在酵母中表達丁醇代謝關鍵酶，Berezina等在斷乳桿菌中構建表達丙酮丁醇代謝相關基因，可見利用重組菌發酵產丁醇仍是生物丁醇研究的方向。通過檢索，并未發現與本專利申請相關的專利公開文獻。
技術實現思路
本專利技術的目的在于克服現有技術的不足之處，提供了，旨在從不同的環境樣品中分離篩選能夠耐受正丁醇的微生物，分離菌株可以作為宿主菌，異源表達正丁醇合成途徑的關鍵酶基因，為正丁醇重組菌的構建擴寬了思路。本專利技術實現目的的技術方案如下一種正丁醇耐受菌株,名稱為YY-23,分類名稱為Pseudomonas stutzeri,保藏編號為CGMCCNo. 6771，保藏日期2012年11月2日，保藏地址為北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。如上所述的正丁醇耐受菌株在構建正丁醇高產菌株中的應用。如上所述的正丁醇耐受菌株篩選方法，在篩選過程中采用將不同環境樣品培養在富集培養基中進行分離，獲得分離菌株，再將分離菌株培養在添加不同濃度正丁醇的耐受培養基中，用分光光度計測定菌體密度的方法測定菌體的相對生長率，獲得正丁醇耐受菌株。而且，所述的正丁醇耐受菌株篩選方法，具體步驟如下⑴正丁醇耐受菌株的富集與分離取不同環境樣品，分別與生理鹽水混合后稀釋，于220rpm震蕩30min,靜止15min,取上清液，按上清液與富集培養基的體積比為1:15，將上清液分別加入添加到含有正丁醇 的富集培養基中，混合液放于35° C恒溫培養22-26h ;取混合液上清按體積比為1:15分別添加到含有不同質量濃度正丁醇的富集培養基中，混合液放于35° C恒溫培養22-26h，重復上述富集步驟3次以上，將富集培養液梯度稀釋、涂布于添加10g/L正丁醇的固體富集培養基，35° C下培養72h后，在固體富集培養基中生長的菌株為分離菌株；⑵耐受分析將分離菌株接種于種子液體培養基，于35° C活化為一級和二級種子；吸取二級種子液按5%的接種量接種于耐受培養基中，35° C220rpm培養24h，在600nm波長下，用分光光度計測定菌體密度，計算菌株的相對生長率，經篩選，即可獲得正丁醇耐受菌株。而且，所述不同環境樣品為楊樹林土壤、松樹林土壤、甜瓜地土壤、花生地土壤、污水與污泥、沼氣池殘洛、淀粉廠排污口土壤、山東段黃河水、山東段河床土壤、天津渤海灣海水或天津渤海灣海沙。而且，所述富集培養基為NaCl 10g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、正丁醇10g/L或50g/L,調節酸堿度至pH7. 0,121° C,滅菌20min。而且，所述耐受培養基為=KH2PO4O.5g/L、K2HPO4O. 5g/L、FeSO4 7H200. 01g/L、MgSO4O. 2g/L、NaC19g/L、蛋白胨5g/L和葡萄糖30g/L，分別補充質量分數為1%或2%或3%的正丁醇，調節酸堿度至PH7. 0，121° C，滅菌20min。而且，還包括對篩選所得正丁醇耐受菌株進行菌種鑒定，步驟如下(I) DNA提取方法苯酚-氯仿-異戊醇法抽提；(2) 16S rRNA 引物正向引物SEQN0. 1，反向引物SEQN0. 2 ；(3) PCR 反應體系10 X Reaction Buffer5. Ou L ；dNTP2. 5mmol/L4. 0 U L ；正向引物lOuMol/Ll. Ou L ;反向引物lOuMol/Ll. Ou L ;Taq 聚合酶 5U/ U L0. 8 U L ；DMS01 u L ；模版DNA50ng/ U L2. 0 U L ；補加重蒸水至50 ii L ;(4) PCR 擴增程序95。ClOmin ；94 ° Clmin，53。C45s，72。Clmin，33 個循環；72° ClOmin ；(5)數據處理凝膠純化PCR并被測序，使用NCBI Blast分析分離菌株的同源性，并使用Ribosomal Database Project II軟件Classifier,對分離的菌株進行分類。本專利技術的優點和積極效果為I、本專利技術正丁醇耐受菌株，可以作為宿主菌，異源表達正丁醇合成途徑的關鍵酶基因，可得到正丁醇產量較高的重組菌株，為正丁醇重組菌的構建擴寬了思路。2、本專利技術正丁醇耐受菌株的篩選方法工藝簡單、操作方便，從不同的環境樣品中分離篩選能夠耐受正丁醇的微生物，針對分離菌株進行了正丁醇耐受能力的測定，利用相對生長率計算分離菌株的耐受能力，獲得了耐受能力強的菌株。附圖說明圖I為本專利技術篩選方法篩選得到的分離菌株的相對生長率圖；其中，A :在1%正丁醇濃度下分離菌株的相對生長率:在2%正丁醇濃度下分離菌株的相對生長率；C :在3%正丁醇濃度下分離菌株的相對生長率；圖2為本專利技術篩選方法得到菌株的基因組電泳圖；圖3為本專利技術PCR方法擴增分離菌株16S rRNA基因片段電泳圖。具體實施例方式下面通過具體實施例對本專利技術作進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本專利技術的保護范圍。需要說明的是 從各種環境中(楊樹林土壤、松樹林土壤、甜瓜地土壤、花生地土壤、污水與污泥、沼氣池殘洛、淀粉廠排污口土壤、山東段黃河水和河床土壤以及天津渤海灣海水和海沙等)采取樣品分離得到的微生物，其耐受正丁醇能力不同，因此采用相對生長率來分析菌株的分離菌株的耐受情況，從而篩選出耐受能力較強的微生物。分離菌株的來源為不同地域的不同生態環本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種正丁醇耐受菌株，其特征在于：名稱為YY?23，分類名稱為PSeudomonas?stutxeri,保藏編號為：CGMCCNo.6771，保藏日期：2012年11月2日，保藏地址為：北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
【技術特征摘要】
1.一種正丁醇耐受菌株，其特征在于名稱為YY-23，分類名稱為PSeudomonasstutxeri,保藏編號為CGMCCNo. 6771，保藏日期:2012年11月2日，保藏地址為北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。2.如權利要求I所述的正丁醇耐受菌株在構建正丁醇高產菌株中的應用。3.—種如權利要求I所述的正丁醇耐受菌株篩選方法，其特征在于在篩選過程中采用將不同環境樣品培養在富集培養基中進行分離，獲得分離菌株，再將分離菌株培養在添加不同濃度正丁醇的耐受培養基中，用分光光度計測定菌體密度的方法測定菌體的相對生長率，獲得正丁醇耐受菌株。4.根據權利要求3所述的正丁醇耐受菌株篩選方法，其特征在于具體步驟如下 ⑴正丁醇耐受菌株的富集與分離 取不同環境樣品，分別與生理鹽水混合后稀釋，于220rpm震蕩30min,靜止15min,取上清液，按上清液與富集培養基的體積比為1:15，將上清液分別加入添加到含有正丁醇的富集培養基中，混合液放于35° C恒溫培養22-26h ;取混合液上清按體積比為1:15分別添加到含有不同質量濃度正丁醇的富集培養基中，混合液放于35° C恒溫培養22-26h，重復上述富集步驟3次以上，將富集培養液梯度稀釋、涂布于添加10g/L正丁醇的固體富集培養基，35° C下培養72h后，在固體富集培養基中生長的菌株為分離菌株； ⑵耐受分析 將分離菌株接種于種子液體培養基，于35° C活化為一級和二級種子；吸取二級種子液按5%的接種量接種于耐受培養基中，35° C220rpm培養24h，在600nm波長下，用分光光度計測定菌體密度，計算菌株的相對生長率，經篩選，即可獲得正丁醇耐受菌株。5.根據權利要求3或4所述的正丁醇耐受菌株的篩選方法，其特征在于所述不同環境樣品為楊樹林土壤、松樹林土壤、甜瓜地土壤、花生地土壤、污水與污泥、沼氣...
【專利技術屬性】
技術研發人員：楊洪江，于越，
申請(專利權)人：天津科技大學，
類型：發明
國別省市：
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