本發明專利技術公布了一種豬肉及其制品中弓形蟲RT-LAMP快速檢測方法。現有技術中檢測時間長且繁瑣，工作量大，很難適應現代化食品安全快速檢測的需要。本發明專利技術取樣加入Trizol試劑，離心取上清液加入200?l氯仿，充分混合離心后取上清液，加入與該上清液等體積的異丙醇，離心后加入1ml體積含量為75%的乙醇，離心后干燥沉淀物，加入20?lRNase-free水溶解沉淀物，得到RNA提取物；將RT-LAMP擴增反應體滅活BstDNA聚合酶，得到擴增產物；加入1μL的SYBRGreenⅠ染料，或于2.0%瓊脂糖凝膠上進行電泳，觀察結果。本發明專利技術具有較高的特異性和靈敏度，且避免假陽性的出現。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物
,涉及一種快速檢測肉制品中弓形蟲(7 gondii)的逆轉錄環介導等溫擴增技術(Reverse Transcription Loop-Mediated IsothermalAmplification, RT-LAMP)檢測方法，具體涉及一種豬肉及其制品中弓形蟲RT-LAMP快速檢測方法。
技術介紹
弓形蟲病(toxoplasmosis)由剛地弓形蟲)引起的一種人畜共患病，弓形蟲病不僅給養豬業造成巨大損失，還嚴重威脅著人類的食品衛生安全和人類健康。豬肉是人們生活中最主要的動物性食品來源，人群可通過攜帶弓形蟲的豬肉、肝臟等 動物源性產品而感染，豬弓形蟲病的高發嚴重威脅著人類健康，對公共食品安全造成極大危害，目前，弓形蟲的檢測主要依靠血清學、病原形態鑒定等傳統方法，然而，這些檢測方法都有不足之處，如檢測時間長，檢測程序繁瑣，工作量大，很難適應現代化食品安全快速檢測的需要，嚴格的病原體檢測是保障食品安全的重要環節，因此亟需建立一種操作簡便、快速準確、靈敏度和特異性都較高的現代化檢測弓形蟲方法。逆轉錄環介導等溫擴增技術(ReverseTranscription Loop-MediatedIso thermal Amp I i f i cat i on, RT-LAMP)特點是針對祀基因的8個區域設計6種特異性引物，利用鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在大約65°C恒溫條件下保溫I小時左右即可完成核酸擴增反應，通過直接觀察擴增副產物焦磷酸鎂沉淀的濁度即可判斷擴增反應是否進行，具有高特異性、高效性、快速、簡便、易檢測等特點。弓形蟲核糖體RNA (ISsRNA)具有很好的種屬特異性，而且18sRNA占細胞RNA總數的80%以上，以弓形蟲18sRNA為目的基金診斷肉制品中弓形蟲可以提高檢測方法的特異性及敏感性，基于ISsRNA的優異性，結合RT-LAMP的快速、簡便等優點，建立以18sRNA為目的基因的RT-LAMP快速檢測方法，從而為肉制品的安全檢測提供有效的手段和研究工具，為動物源性食品安全的監控及政府決策提供系統、科學的資料與依據。
技術實現思路
本專利技術的目的是針對現有技術的不足，提供一種豬肉及其制品中弓形蟲RT-LAMP快速檢測方法。本專利技術解決其技術問題所采用的技術方案如下 步驟(I).樣品前處理 豬肉及其制品取樣25g，加入10倍豬肉及其制品體積的滅菌蒸餾水中，用組織勻漿機均質I min,制成組織勻楽；樣品； 步驟(2).弓形蟲RNA提取 取組織勻漿樣品轉移到離心管后，加入Trizol試劑，其中組織勻漿樣品與Trizol試劑的體積含量比為1:10，常溫靜置5min ;在轉速12000rpm，溫度為4 °C條件下離心5 min，取上清液至新的離心管中，加入200 μ 氯仿，蓋上離心管蓋，充分混合至溶液呈乳白狀后，常溫靜置5min ;在轉速12000rpm，溫度為4 °C條件下離心10 min，取上清液至新的離心管中，加入與該上清液等體積的異丙醇，充分混合后，常溫靜置10 min ;在轉速12000rpm，溫度為4 °C條件下離心10 min，棄掉上清液，加入I ml體積含量為75%的乙醇洗滌離心管壁，在轉速12000 rpm，溫度為4 °C條件下離心10 min后，取沉淀物；常溫下干燥沉淀物5min，力口入20 μ RNase-free水溶解沉淀物，得到RNA提取物； 將RNA提取物采用核酸蛋白檢測儀測定模板DNA的濃度與純度； 步驟(3). RT-LAMP擴增 將RT-LAMP擴增反應體系振蕩混勻后，置于65°C水浴鍋中反應I h后，置于80°C水浴鍋中2 min滅活Bst DNA聚合酶，得到擴增產物； 所述的RT-LAMP擴增反應體系為25 μ I由2 μ I的25 mmol/L MgCl2,6. O μ I的2. 5mmol/L dNTPs,0. 5μ I 的 RNA 酶抑制劑，2· 5 μ I 的 IOXBst DNA Buffer, O. 5 μ I 的 10mmol/L F3 引物，0· 5 μ I 的 10 mmol/L Β3 引物，2· 5μ I 的 10 mmol/L FIP 引物，2· 5μ I 的10 mmol/L BIP 引物，L O μ I 的 10 mmol/L LF 引物，L O μ I 的 10 mmol/L LB 引物，2. O μ I的5 mol/L甜菜堿，1.0μ I的反轉錄酶，1.0μ I的Bst DNA聚合酶，2. O μ I的RNA提取物組成； 步驟(4).擴增產物電泳檢測 反應結束后，在擴增產物中直接加入I μ L的SYBR Green I染料，混勻后置于桌面上拍照并肉眼觀察結果；顏色變為綠色為陽性，說明有弓形蟲感染，橙色則為陰性，說明無弓形蟲感染；或取擴增產物2 3 yL，于2.0%瓊脂糖凝膠上進行電泳，通過凝膠成像系統觀察結果，有梯形條帶為陽性，說明有弓形蟲感染，無條帶則為陰性，說明無弓形蟲感染。本專利技術的有益效果本專利技術進行了反應的特異性驗證和靈敏度檢驗，證明了引物設計的種間特異性和種內保守性，確保該反應能特異性檢測出目標病原體，而避免假陽性的出現；同時確認了該方法可以檢測出至少I個弓形蟲速殖子。具體實施例方式下面對本專利技術作進一步的分析。實施例I 步驟(I).樣品前處理 取可疑病豬肉25g，加入10倍可疑病豬肉體積的滅菌蒸餾水中，用組織勻漿機均質Imin,制成組織勻楽；樣品； 步驟(2).弓形蟲RNA提取 取組織勻漿樣品轉移到離心管后，加入Trizol試劑，其中組織勻漿樣品與Trizol試劑的體積含量比為1:10，常溫靜置5min ;在轉速12000rpm，溫度為4 °C條件下離心5 min，取上清液至新的離心管中，加入200 μ 氯仿，蓋上離心管蓋，充分混合至溶液呈乳白狀后，常溫靜置5min ;在轉速12000rpm，溫度為4 °C條件下離心10 min，取上清液至新的離心管中，加入與該上清液等體積的異丙醇，充分混合后，常溫靜置10 min ;在轉速12000rpm，溫度為4 °C條件下離心10 min，棄掉上清液，加入I ml體積含量為75%的乙醇洗滌離心管壁，在轉速12000 rpm，溫度為4 °C條件下離心10 min后，取沉淀物；常溫下干燥沉淀物5min，力口入20 μ RNase-free水溶解沉淀物，得到RNA提取物； 將RNA提取物采用核酸蛋白檢測儀測定模板DNA的濃度與純度； 步驟(3). RT-LAMP擴增 將RT-LAMP擴增反應體系振蕩混勻后，置于65°C水浴鍋中反應I h后，置于80°C水浴鍋中2 min滅活Bst DNA聚合酶，得到擴增產物； 所述的RT-LAMP擴增反應體系為25 μ I由2 μ I的25 mmol/L MgCl2,6. O μ I的2. 5mmol/L dNTPs,0. 5μ I 的 RNA 酶抑制劑，2· 5 μ I 的 IOXBst DNA Buffer, O. 5 μ I 的 10mmol/L F3 引物，0· 5 μ I 的 10 mmol/L Β3 引物，2· 5μ I 的 10 mmol/L FI本文檔來自技高網...
【技術保護點】
豬肉及其制品中弓形蟲RT？LAMP快速檢測方法，其特征在于該方法包括以下步驟：步驟(1).樣品前處理豬肉及其制品取樣25g，加入10倍豬肉及其制品體積的滅菌蒸餾水中，用組織勻漿機均質1？min，制成組織勻漿樣品；步驟(2).弓形蟲RNA提取取組織勻漿樣品轉移到離心管后，加入Trizol試劑，其中組織勻漿樣品與Trizol試劑的體積含量比為1:10，常溫靜置5min；在轉速12000rpm，溫度為4？℃條件下離心5？min，取上清液至新的離心管中，加入200？μl氯仿，蓋上離心管蓋，充分混合至溶液呈乳白狀后，常溫靜置5min；在轉速12000rpm，溫度為4？℃條件下離心10？min，取上清液至新的離心管中，加入與該上清液等體積的異丙醇，充分混合后，常溫靜置10？min；在轉速12000rpm，溫度為4？℃條件下離心10？min，棄掉上清液，加入1？ml？體積含量為75%的乙醇洗滌離心管壁，在轉速12000？rpm，溫度為4？℃條件下離心10？min后，取沉淀物；常溫下干燥沉淀物5min，加入20？μl？RNase？free水溶解沉淀物，得到RNA提取物；將RNA提取物采用核酸蛋白檢測儀測定模板DNA的濃度與純度；步驟(3).RT？LAMP擴增將RT？LAMP擴增反應體系振蕩混勻后，置于65℃水浴鍋中反應1？h后，置于80℃水浴鍋中2？min滅活Bst？DNA聚合酶，得到擴增產物；所述的RT？LAMP擴增反應體系為25？μl由2μl的25？mmol/L？MgCl2，6.0？μl？的2.5？mmol/L？dNTPs，0.5μl的RNA酶抑制劑，2.5？μl的10×Bst？DNA？Buffer，0.5？μl的10？mmol/L？F3引物，0.5？μl的10？mmol/L？B3引物，2.5μl的10？mmol/L？FIP引物，2.5μl的10？mmol/L？BIP引物，1.0μl的10？mmol/L？LF引物，1.0μl的10？mmol/L？LB引物，2.0？μl的5？mol/L甜菜堿，1.0μl的反轉錄酶，1.0μl的Bst？DNA聚合酶，2.0μl的RNA提取物組成；步驟(4).擴增產物電泳檢測：反應結束后，在擴增產物中直接加入1μL的SYBR？GreenⅠ染料，混勻后置于桌面上拍照并肉眼觀察結果；顏色變為綠色為陽性，說明有弓形蟲感染，橙色則為陰性，說明無弓形蟲感染；或取擴增產物2～3？μL，于2.0%瓊脂糖凝膠上進行電泳，通過凝膠成像系統觀察結果,有梯形條帶為陽性，說明有弓形蟲感染，無條帶則為陰性，說明無弓形蟲感染。...
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：曲道峰，韓劍眾，陶斯悅，鄭柏玲，蘇春雷，杜愛芳，池娜，
申請(專利權)人：浙江工商大學，
類型：發明
國別省市：
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