浙貝母PCR鑒定試劑盒及鑒定方法技術

本發明專利技術公開了一種浙貝母PCR鑒定鑒定試劑盒及鑒定方法，所述試劑盒中的特異性引物為ZB1和ZB2，ZB1：5'-ACAGTACTGGGGGAGAAGTC-3'，ZB2：5'-CAAATGGAGGGTATGTGTCG-3'；本發明專利技術根據凝膠電泳在719bp處有無擴增條帶作為鑒定浙貝母的依據，可以檢測單個或者混合貝母DNA樣品，本發明專利技術提供了一種快速、準確鑒定浙貝母的方法，可以廣泛應用于浙貝母中藥選種育種、種植、采收儲存、銷售、臨床應用各環節的品種鑒定，在鑒別中藥真偽，打擊偽品，加強中藥質量監管，促進中藥現代化發展方面具有重大意義。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種中藥材浙貝母的DNA分子鑒定方法，特別涉及中藥浙貝母PCR鑒定試劑盒、特異性引物、模板及鑒定方法。
技術介紹
浙貝母是一種常用中藥，具有止咳化痰的療效，是道地藥材“浙八味”之一。除了浙貝母外，藥典記載的貝母品種包括川貝、湖北貝母、平貝母和伊貝母，另外流通領域還存在浙貝母的偽品草貝母和土貝母。貝母因為品種的不同，藥效差別較大，偽品具有毒性，而且各品種之間價格差異非常大，對浙貝母進行鑒定具有重要意義。浙貝母與其他品種外觀 非常相似，利用常規的中藥鑒定方法很難將它們進行區分鑒別。當藥材加工成粉末后就更加難以鑒定。利用DNA分子鑒定方法能夠解決浙貝母鑒別困難的問題，因為這種方法能夠從基因水平上進行品種的甄別，具有準確、高效、重復性好，不受樣品產地、生長環境和來源的影響。本專利技術提供的PCR檢測法就是一種浙貝母的DNA分子鑒定方法，能夠準確鑒定浙貝母。目前此種方法在浙貝母鑒定中的應用在專利號03113004. 6公開說明書中有所描述，但是使用的引物序列是利用GeneBank數據庫下載的貝母植物RNA分子的序列隨機設計的。本專利技術提供的引物是根據浙貝母基因組中的特異性DNA分子標記的序列設計的，所獲引物的獲取途徑和序列與專利號03113004. 6公開說明書中所述完全不同。由于本專利技術提供的引物序列是建立于浙貝母區別于其他品種的特異性DNA分子標記的篩選、克隆和測序工作上的成果，因此，應用該引物的PCR檢測法準確性和靈敏度更高，能用于檢測混合DNA樣品。并且，本專利技術提供的PCR檢測法在檢測步驟和檢測結果判斷依據上也與專利號03113004. 6公開說明書中的所述內容不同。
技術實現思路
本專利技術目的是提供一種能夠準確鑒定中藥浙貝母的PCR鑒定試劑盒及檢測法，包括PCR檢測法關鍵試劑PCR引物、模板和PCR檢測法的檢測步驟。本專利技術采用的技術方案是本專利技術提供一種浙貝母PCR鑒定試劑盒，所述試劑盒中的特異性引物為ZBl和ZB2 ZBl : 5’-ACAGTACTGGGGGAGAAGTC-3’，ZB2 :5’-CAAATGGAGGGTATGTGTCG-3’ 。進一步，所述浙貝母PCR鑒定試劑盒的組成為IOxPCRbpffer2μ MgCl2(25 inM)l.2.uL dNl-Ps(iOmM)O.SpLTaq DNA polymeraseI 2 單位引物 ZBl (20μΜ)0.5pL引物 ΖΒ2 (20μΜ)0.5pLo 本專利技術還涉及一種適于本專利技術浙貝母PCR鑒定試劑盒的浙貝母基因，所述浙貝母基因的核苷酸序列為SEQ ID NO. I所示。SEQ ID NO. I 序列5，- .(cgacgaagaaI cggacagtactgggggagaagtcaaatactgttttatctgcctgaaggctGCTTCGCACTCTTCCGTCCATTCAAACTCTCTGCTTCCTCATAGCATCGCTGTAAAAGTTTTTATCTTGTCCGATGATCTTGATATGAAGCGGTAAAGGGCTGCTATTCTTCCACTCAGTACCTGTATGTCTTTCACTGTTTTGGGGCTTTCCATCCCCAGTATCGATTTTGTTTGCGCTGGATCTGCGCTGATTCTCTTCTTGTGCACTATGTGCCCTAAGAACTTACCTAAAGCTACTCCAAATATGCATTTTTTTGGATTCAATTTCAGGGAGAAGATGCGTAATCGGTCGAAGGCCTCCTCTAGGTTCTGGATATGATCCTCCTTTTTAGAACTTTTTACCAGTAAATCATCAATTTATGTGCCTACTGTTTTCCCTAGTAGCCCTTGAAAGATTCTGGTAATCAACCGTTGAAAAGTTGCTCCTGCATTCTTAAGTCCAAAGGGCATCACCGTGTAGCAATATAACCCTAAGGGAGTAGTGAAACTGGTGTGTTCCTCATCTTGCAGATTTAACTTGATTTGATTATAGCCTGAACAGGCATCCAAAAAAGATATCCTCTCGTGACCCACCAGTGAGTCCACCAACTGGCATATCCGTGGTAGCGGGAAACTGTCCTTGGGACAGGCTTTATTTAGATCTGTGTAGTCGACACATACCCTCCATTTGCCG " ΤΓΤΤ(、( ?！甫? ;| -3，框內序列為RAPD引物序列。本專利技術所述核苷酸序列為SEQ ID NO. I所示的基因是根據常規提取法(CTAB法)從浙貝母、川貝母、湖北貝母、平貝母、伊貝母中提取基因組DNA。使用RAH)擴增法對五種貝母進行RAH)分析，篩選獲得一條浙貝母特異性擴增條帶，這條擴增條帶只出現在浙貝母品種中，在其他貝母品種中沒有，此條帶中的DNA分子即是浙貝母特異性DNA分子標記。將浙貝母特異性DNA分子標記從膠中回收，克隆，測序后獲得。本專利技術涉及一種利用所述浙貝母PCR鑒定試劑盒對浙貝母進行鑒定的方法，所述方法為(I)模板DNA的提取和質量鑒定采用常規提取法提取供試品DNA作為PCR的模板；以電泳法檢測模板DNA的質量(檢測方法同步驟(3))，條帶清晰無彌散的，即為符合PCR反應的模板DNA ；(2)PCR鑒定利用浙貝母PCR鑒定試劑盒中的特異性引物ZBl和ZB2進行PCR擴增PCR反應溶液I OxPCRbpffer2^L Mg€l2(25 mM)1.2pL dNTPs(lOmM)0.5μ Taq DNA polymeraseI 2 單位引物 ZBl (20μΜ)0.5pL 引物 ΖΒ2 (20μΜ)0.5pL模板DNAI 2μ (IdH2Oft]至 20μ 將PCR反應溶液放入PCR自動擴增儀器中進行PCR擴增反應，反應程序設置為95°C預變性5min，95°C變性30s，52 60°C復性30s，72。。延伸2min,30個循環，最后72°C延伸5min ；(3) PCR產物進行電泳檢測取出PCR擴增產物(即擴增反應后的反應液)5 μ L與加樣緩沖液I μ L混合，用I. 5%瓊脂糖凝膠電泳(含O. 5%溴化乙錠)檢測擴增結果，在719bp處出現擴增條帶的為浙貝母，在719bp處不出現擴增條帶的不是浙貝母。與現有技術相比，本專利技術的有益效果主要體現在(1)本專利技術根據凝膠電泳在719bp處有無擴增條帶作為鑒定浙貝母的依據，可以檢測單個或者混合貝母DNA樣品，檢測準確、靈敏度高、操作簡單、耗時短、重復性好；(2)利用浙貝母PCR鑒定試劑盒中引物ZBl和ZB2以及PCR反應溶液配方可以制造浙貝母鑒定試劑盒；(3)本專利技術提供了一種快速、準確鑒定浙貝母的方法，可以廣泛應用于浙貝母中藥選種育種、種植、采收儲存、銷售、臨床應用各環節的品種鑒定，在鑒別中藥真偽，打擊偽品，加強中藥質量監管，促進中藥現代化發展方面具有重大意義。附圖說明圖I十三種供試品經PCR檢測法鑒定后的電泳圖，泳道f 13分別為為蒜、蔥、黃精、玉竹、郁金香、百合、湖北貝母、川貝母、平貝母、伊貝母、土貝母、草貝母、浙貝母，泳道M為 markerο圖2為不同濃度的浙貝母經PCR檢測本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種浙貝母PCR鑒定試劑盒，其特征在于所述試劑盒中的特異性引物為ZB1和ZB2：ZB1：5“？ACAGTACTGGGGGAGAAGTC？3“，ZB2：5“？CAAATGGAGGGTATGTGTCG？3“。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：李敏，趙欣，黃龍妹，陳劍，
申請(專利權)人：浙江工業大學，
類型：發明
國別省市：