本發(fā)明專利技術(shù)提供一種檢測KRAS基因第2外顯子密碼子12、13和第3外顯子密碼子61突變的測序引物對及其試劑盒，屬于體外核酸檢測領(lǐng)域，所述試劑盒包括尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶、PCR擴增引物以及測序引物；本發(fā)明專利技術(shù)提供的試劑盒靈敏度高，特異性好，PCR產(chǎn)物簡單處理即可上焦磷酸測序儀測序，操作簡便，反應(yīng)時間短，比金標準——毛細管電泳測序靈敏度高，更適合用于突變分析。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及體外核酸檢測領(lǐng)域，采用PCR結(jié)合焦磷酸測序技術(shù)，用于檢測患者組織DNA中KRAS基因型，具體涉及一種定性檢測KRAS基因分型的測序引物對及其試劑盒。
技術(shù)介紹
RAS基因家族與人類 腫瘤相關(guān)的基因有三種——HRASjKRAS和NRAS，其中KRAS對人類癌癥影響最大，它好像分子開關(guān)當正常時能控制調(diào)控細胞生長的路徑；異常時該基因永久活化，導(dǎo)致細胞持續(xù)生長，并阻止細胞自我毀滅，使細胞增殖失控而癌變(見圖I )。據(jù)統(tǒng)計，KRAS突變型結(jié)直腸癌患者約占30-40%，在肺癌患者中突變率約占20-30%。NCCN專家組認為，KRAS突變是結(jié)直腸癌形成過程中的早期事件，并且原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的KRAS基因高度保持一致，可用于早期診斷和復(fù)發(fā)的及時監(jiān)測。檢測KRAS基因突變是深入了解癌基因的情況、了解結(jié)直腸癌等惡性腫瘤的發(fā)展預(yù)后、評估放化療療效的重要指標為結(jié)直腸癌等惡性腫瘤的早期診斷提供依據(jù)科學研究發(fā)現(xiàn)，人體內(nèi)從單個細胞開始到形成米粒大小的腫瘤，需要8 10年，在此階段人體幾乎沒有任何癥狀；從米粒大小的腫瘤發(fā)展成杏仁大小的腫瘤，只需I年左右；如果沒有及時發(fā)現(xiàn)，杏仁大小的腫瘤發(fā)展到晚期只需要2 6個月。近幾年西妥昔單抗、帕尼單抗等靶向藥物(表皮生長因子受體(EGFR)抑制劑)聯(lián)合化療的應(yīng)用為廣大結(jié)直腸癌患者帶來福音。KRAS基因檢測已被寫入最新版《美國國立癌癥綜合網(wǎng)絡(luò)(NCCN)結(jié)直腸癌臨床實踐指南》。新指南傳遞出了兩條重要的信息一是所有轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者都應(yīng)檢測KRAS基因狀態(tài)；二是只有KRAS野生型患者才建議接受EGFR抑制劑如西妥昔單抗和帕尼單抗治療(見圖I)。另外，《09年NCCN非小細胞肺癌臨床實踐指南》明確指出當KRAS基因發(fā)生了突變，則不建議病人使用特羅凱進行分子靶向治療。為癌癥患者的預(yù)后提供指導(dǎo)。例如Ryan et al (2003)發(fā)表在頂尖雜志⑶T(IF>10)的文章指出，術(shù)后血清KRAS基因突變檢測對于腫瘤的預(yù)后具有重要作用術(shù)后血清KRAS基因突變檢測陽性者復(fù)發(fā)率高達63%，而術(shù)后血清KRAS基因突變檢測陰性者的復(fù)發(fā)率僅為2%。a. EGFR被TGF a、EGF等配體激活后啟動細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，維持細胞存活，促進細胞增殖、轉(zhuǎn)移，在存在血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的條件下還可促進新生血管生成。b.腫瘤的靶向治療藥物如抗EGFR單抗(西妥昔單抗、帕尼單抗等)通過阻斷EGFR二聚體的形成，抑制其下游的細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，從而抑制腫瘤細胞的存活、增殖、轉(zhuǎn)移以及新生血管生成。c. KRAS基因突變可旁路激活細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，從而導(dǎo)致抗EGFR單抗喪失抗癌活性。目前醫(yī)院用于KRAS基因檢測的“金標準”是PCR-直接測序法，但直接測序法的敏感性不高，只能檢測出突變細胞比率在10-20%以上的腫瘤組織，對于含〈10%突變細胞的腫瘤組織以及外周血，常規(guī)PCR+直接測序法幾乎無能為力。相比于直接測序法，焦磷酸測序的靈敏性更高、成本更低。焦磷酸測序(Pyrosequencing)是一種基于聚合原理的DNA測序(確定DNA中核苷酸的順序)方法，是新一代DNA序列分析技術(shù)。它是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級聯(lián)化學發(fā)光反應(yīng)，在每一輪測序反應(yīng)中，只加入一種dNTP，若該dNTP與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸基團(PPi)。PPi可最終轉(zhuǎn)化為可見光信號，并由PyrogramTM轉(zhuǎn)化為一個峰值。每個峰值的高度與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。然后加入下一種dNTP，繼續(xù)DNA鏈的合成。通過分析出峰情況，達到測定DNA序列的目的。目前市場上還沒有利用焦磷酸技術(shù)進行KRAS的基因多態(tài)性檢測的產(chǎn)品。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種特異性高、成本低、定量、準確檢測KRAS的基因突變的測序引物對及其試劑盒?！榱诉_到上述目的，本專利技術(shù)采用如下技術(shù)方案一種檢測KRAS基因分型的測序引物對，所述引物對為如下引物KRAS1213 正向擴增引物5' -TATAAGGCCTGCTGAAAATGACTG-3' (SEQ ID NO. I)；KRAS1213 反向擴增引物5' -TATTCGTCCACAAAATGATTCTGA-3' (SEQ ID NO. 2)KRAS1213 測序引物5' -GCACTCTTGCCTACG-3' (SEQ ID N0:3)KRAS6I 正向擴增引物5' -AATTGATGGAGAAACCTGTCTCTT-3; (SEQID NO. 4)KRAS61 反向擴增引物5' -TCCTCATGTACTGGTCCCTCATT-3' (SEQID NO. 5)KRAS61 測序引物5' -CTCGACACAGCAGGT-3' (SEQ ID NO. 6)其中，KRAS1213正向擴增引物(SEQ ID NO. I)和 KRAS61 (SEQ ID NO. 5)反向擴增引物的5'端分別進行生物素標記。一種定性檢測KRAS基因分型的測序試劑盒，所述試劑盒包括含有SEQ IDN0. 2所示反向擴增引物的PCR反應(yīng)液1，含有SEQ ID NO. 4所示正向擴增引物的PCR反應(yīng)液2，SEQID NO. I所示的正向擴增引物，SEQ ID NO. 5所示的反向擴增引物，SEQ ID NO. 3和SEQ IDNO. 6所示的測序引物；其中，SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 5所示引物的5’端進行生物素標記。進一步地，所述試劑盒中還包括質(zhì)控品TAYGGTTTGCA (SEQ ID NO. 7) (controloligo)和作為空白對照品的超純水；質(zhì)控序列是由QIAGEN設(shè)計合成的一段寡聚核苷酸鏈，用于檢測PyroMark Q24測序儀的各項性能指標。進一步地，所述試劑盒還包括KRAS1213陽性對照品1，KRAS1213陽性對照品2，；KRAS61陽性對照品1，KRAS61陽性對照品2 ；所述KRAS1213陽性對照品I為插有SEQ ID NO. 8所示核苷酸序列的KRAS1213野生純合子質(zhì)粒；所述KRAS1213陽性對照品2為所述KRAS1213野生純合子質(zhì)粒與插有SEQID NO. 9所示核苷酸序列的KRAS1213突變純合子質(zhì)粒組成的質(zhì)?；旌衔?；所述KRAS61陽性對照品I為插有SEQ ID NO. 10所示核苷酸序列的KRAS61野生純合子質(zhì)粒；KRAS61陽性對照品2為所述KRAS61野生純合子質(zhì)粒與插有SEQ ID NO. 11所示核苷酸序列的KRAS61突變純合子質(zhì)粒組成的質(zhì)?；旌衔?；其中，質(zhì)粒載體為pMD18-T質(zhì)粒；所述KRAS1213質(zhì)粒混合物中KRAS1213突變純合子質(zhì)粒和所述KRAS1213野生純合子質(zhì)粒的數(shù)量比為1:1 ;所述KRAS61質(zhì)?；旌衔镏蠯RAS61突變純合子質(zhì)粒和所述KRAS61野生純合子質(zhì)粒的數(shù)量比為1:1。所述的PCR反應(yīng)液I和PCR反應(yīng)液2中其他組分為常規(guī)的IOx PCR Buffer^dNTPs和H2O,各組分按常規(guī)體積比配置(10x PCR Buffer、dNTPs、H20和反應(yīng)液中引物的體積比為5:3:37. 5:1)。試劑盒中其他試劑及溶液為PCR和DNA焦磷酸測序的常規(guī)試劑，如由DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、熒光本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種定性檢測KRAS基因分型的測序引物對，其特征在于，所述引物對為SEQ？IDNO.1和SEQ？ID？NO.4所示的正向擴增引物，SEQ？ID？NO.2和SEQ？ID？NO.5所示的反向擴增引物，SEQ？ID？NO.3和SEQ？ID？NO.6所示的測序引物；其中，SEQ？ID？NO.1和SEQ？IDNO.5所示引物的5’端進行生物素標記。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：肖芳，
申請(專利權(quán))人：長沙三濟生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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