一種鑒定凝結芽孢桿菌的方法技術

本發明專利技術涉及一種鑒定凝結芽孢桿菌的方法，具體涉及一種新的鑒定凝結芽孢桿菌的分子生物學方法。該方法通過對凝結芽孢桿菌基因特異的DNA序列設計特異性引物：HFQ1/HFQ2，用該引物對待測樣品的基因組DNA進行PCR擴增檢測，可以將凝結芽孢桿菌菌株鑒定到種的水平。本發明專利技術將為凝結芽孢桿菌鑒定提供一種更加準確、更易于操作的實用方法，有利于凝結芽孢桿菌菌株的分類及研究工作。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種微生物額鑒定方法，具體涉及，屬于分子生物學的
。
技術介紹
凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)呈桿狀,兩端鈍圓,革蘭氏陽性菌,過氧化氫酶陽性，芽胞端生，無鞭毛。最適生長溫度為45~50°C,最適pH值為6.6~7.0。其能分解糖類生成L-乳酸，為同型乳酸發酵菌。是經美國FDA批準的一種“普遍認為安全”的桿菌類乳酸菌。凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)是近年來益生菌領域的后起之秀,其除具有乳酸菌和雙歧桿菌等保健功效外，還具有耐高溫、耐酸和耐膽鹽等高抗逆性，且具有較強的抑制腸道致病菌能力。在國外已廣泛應用于保健、醫療、食品和畜牧等領域，但在我國關于凝結芽孢桿菌的研究和開發才剛剛起步。凝結芽孢桿菌是造成罐頭食品平蓋酸敗的一種重要微生物。綜上所述，不論是作為益生菌來利用，還是作為酸敗的罪魁禍首，都需要一種快速的鑒定方法，而傳統的生化鑒定操作繁瑣、檢測時間長，已經不能滿足各個領域的需求，因而，對凝結芽孢桿菌快速檢測的研究是很有必要的。PCR方法具有檢測速度快、靈敏度高、成本低的優點，是當前細菌鑒定中一種快速有效的方法。
技術實現思路
本專利技術的目的在于，提供，以克服現有技術所存在的上述缺點和不足。本專利技術提供一種檢測速度快、成本低的快速檢測凝結芽孢桿菌到種的PCR方法。本專利技術所需要解決的技術問題，可以通過以下技術方案來實現:作為本專利技術的第一方面，一種鑒定凝結芽孢桿菌的特異性引物，其特征在于，所述引物是一對特異性引物HFQ1/HFQ2，其中，正向引物HFQl序列與SEQ IDN0.1 相同，為:GTCACGGAAGAGCAAGCTTG ;反向引物 HFQ2 序列與 SEQ ID N0.2 相同，為:GTTTCTGAAATGTATGCACG。作為本專利技術的第二方面，一種特異性引物鑒定凝結芽孢桿菌的方法，其特征在于，包括以下步驟:(I)提取凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans),準備對照菌株；(2)以步驟⑴中的細菌DNA為模板，用HFQ1/HFQ2引物進行PCR擴增；和 (3)用I %瓊脂糖凝膠電泳對上述PCR擴增結果進行驗證。步驟(2)中，正向引物HFQl 序列與 SEQ ID N0.1 相同，為:GTCACGGAAGAGCAAGCTTG ；反向引物 HFQ2 序列與 SEQ ID N0.2 相同，為:GTTTCTGAAATGTATGCACG。步驟(2)中，PCR擴增體系為:20μ1 由 2 μ 110 XBufferwith MgCl2、I μ ldNTP2.5mmol/L、I μ I HFQ11 Ommo I/L、I μ I HFQ2I Ommo I/L、0.I μ I TaqDNAPolymerase5U/ μ 1、I μ I DNA 模板，13.9 μ I ddH20 ；PCR 擴增條件為:預變性 94°C 5min，變性 94°C 35s，退火 50°C 40s，延伸 72°C 40s，30個循環，72°C延伸10min，4°C保存。作為本專利技術的第三方面，一種鑒定凝結芽孢桿菌的特異性引物的用途，其特征在于:用于凝結芽孢桿菌的分子檢測。本專利技術的有益效果:1、較傳統鑒定凝結芽孢桿菌的16sDNA擴增、測序、比對、生理生化試驗等繁雜步驟來說，本專利技術的方法可以直接鑒定出是否是凝結芽孢桿菌，極大程度上節省了實驗資源，可用于大規模樣品的鑒定凝結芽孢桿菌。2、本專利技術的引物是根據凝結芽孢桿菌特異保守基因而設計的，應用本專利技術的引物HFQ1/HFQ2可從各類樣品DNA中直接擴增出長度大約為290bp的凝結芽孢桿菌目的片段。【附圖說明】圖1為實施例1中HFQ1/HFQ2引物對種細菌DNA擴增產物的凝膠電泳圖。M 泳道為標準 DNA markerfOOO。I號泳道為凝結芽孢桿菌的擴增結果。2號泳道為陰性對 照。3-10號泳道分別為含有枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、巨大芽抱桿菌(Bacillus megaterium)、地衣芽抱桿菌(Bacilluslicheniformis)、大腸桿菌標準株(Escherichia coli ATCC25922)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎雙球菌(Pneumococcus)和流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)的 DNA0圖2為實施例2中HFQ1/HFQ2引物對不同樣品DNA擴增產物的凝膠電泳圖。M 泳道為標準 DNA marker2000。I號泳道為凝結芽孢桿菌的擴增結果。2號泳道為陰性對照。3號泳道為土壤A樣品DNA。4號泳道為土壤B樣品DNA。5-號泳道為番爺罐頭A樣品DNA。6號泳道為番爺罐頭B樣品DNA。【具體實施方式】結合以下具體實施例和附圖，對本專利技術作進一步的詳細說明。實施本專利技術的過程、條件、試劑、實驗方法等，除以下專門提及的內容之外，均為本領域的普遍知識和公知常識，本專利技術沒有特別限制內容。實施例1實驗步驟1、提取凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)、臘狀芽抱桿菌(Bacillus cereus)、巨大芽抱桿菌(Bacillus megaterium)、地衣芽抱桿菌(Bacilluslicheniformis)、大腸桿菌標準株(Escherichia coli ATCC25922)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎雙球菌(Pneumococcus)和流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)的 DNA,上述菌種來源見表 I。2、以步驟I中的細菌DNA為模板，用HFQ1/HFQ2引物進行PCR擴增。PCR 擴增體系為:20μ I 由 2μ 110 X Buffer (with MgCl2), I μ I dNTP (2.5mmol/L)、I μ I HFQl(IOmmoI/L)、I μ I HFQ2(IOmmoI/L)、0.I μ I TaqDNA Polymerase(5U/μ I)、I μ IDNA 模板，13.9 μ I ddH20。PCR 擴增條件為:預變性 94°C 5min,變性 94°C 35s，退火 50°C 40s,延伸 72°C 40s，30個循環，72°C延伸10min，4°C保存。3、用I %瓊脂糖凝膠電泳對上述PCR擴增結果進行驗證。實驗結果 檢測結果如圖1所示，從圖1中可以看出本實施方式用于擴增凝結芽孢桿菌的特異性引物HFQ1/HFQ2能夠準確的擴增出凝結芽孢桿菌的靶標序列片段，而未能從其他屬細菌DNA和空白對照中擴增出核酸片段。將I號泳道對應的擴增片段進行測序，經Blast比對分析，確定其為凝結芽孢桿菌特異基因序列。表1菌種來源表本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種鑒定凝結芽孢桿菌的特異性引物，其特征在于，所述引物是一對特異性引物HFQ1/HFQ2，其中，正向引物HFQ1序列與SEQ?ID?NO.1相同，為:GTCACGGAAGAGCAAGCTTG；反向引物HFQ2序列與SEQ?ID?NO.2相同，為:GTTTCTGAAATGTATGCACG。

【技術特征摘要】
1.一種鑒定凝結芽孢桿菌的特異性引物，其特征在于，所述引物是一對特異性引物HFQ1/HFQ2，其中，正向引物 HFQl 序列與 SEQ ID N0.1 相同，為:GTCACGGAAGAGCAAGCTTG ;反向引物 HFQ2 序列與 SEQ ID N0.2 相同，為:GTTTCTGAAATGTATGCACG。2.一種如權利要求1所述的特異性引物鑒定凝結芽孢桿菌的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)提取凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans),準備對照菌株； (2)以步驟⑴中的細菌DNA為模板，用HFQ1/HFQ2引物進行PCR擴增；和 (3)用I%瓊脂糖凝膠電泳對上述PCR擴增結果進行驗證。3.根據權利要求2述的方法，其特征在于:步驟(2)中，正向引物HFQl序列與SEQID N0.1 相同，為:GTCACGGAAGAGCA...

【專利技術屬性】
技術研發人員：符雷，郗洪生，施騰鑫，陸亞怡，
申請(專利權)人：江蘇恒豐強生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：江蘇;32