用于降低非特異性擴增的方法和試劑技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供了用于核酸擴增的方法和試劑。與使用未經(jīng)修飾的寡核苷酸進行的擴增相比較，使用含有N2-芐基-dG核苷酸的探針寡核苷酸進行的擴增和檢測可以導(dǎo)致更少的涉及探針的非特異性擴增，可能這是由于在模板中大量N2-芐基-dG小溝結(jié)合劑的存在防止通過DNA聚合酶的互補鏈的延伸。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】用于降低非特異性擴增的方法和試劑專利
本專利技術(shù)涉及分子生物學(xué)和核酸化學(xué)領(lǐng)域。更具體而言，它涉及用于改進核酸擴增反應(yīng)的可靠性的方法和試劑。專利技術(shù)背景 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的專利技術(shù)使得核酸序列的體外擴增成為可能。PCR在美國專利號 4，683，195 ;4，683，202 ；和 4，965，188 ；Saiki 等人，1985，Science 230:1350-1354 ；Mullis 等人，1986, Cold Springs Harbor Symp.Quant.Biol.51:263-273 ;以及 Mullis 和Faloona, 1987，Methods Enzymo1.155:335-350中描述。PCR的開發(fā)和應(yīng)用在文獻中廣泛描述。例如，一系列 PCR相關(guān)主題在 PCR Technology - principles and applications for DNAamplification, 1989, (H.A.Erlich編輯)Stockton Press, New York ；PCR Protocols: A guideto methods and applications, 1990, (M.A.1nnis 等人編輯)Academic Press, San Diego ；和 PCR Strategies, 1995, (M.A.1nnis 等人編輯)Academic Press, San Diego 中討論。商業(yè)供應(yīng)商例如Applied Biosystems (Foster City, CA)銷售PCR試劑和公開PCR方案。 自從核酸擴增的原始出版物以后，多種基于引物的核酸擴增方法已得到描述，包括但不限于鏈置換測定(Walker 等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 89:392-396，Walker 等人，1992，Nucleic Acids Res.20:1691-1696 和美國專利號 5，455，166)和基于轉(zhuǎn)錄的擴增系統(tǒng)，包括美國專利號5，437，990 ;5，409，818 ;和5，399,491中所述的方法；轉(zhuǎn)錄擴增系統(tǒng)(TAS ) (Kwoh 等人，1989，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 86:1173-1177);和自主序列復(fù)制(3SR) (Guatelli 等人，1990，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 87:1874-1878和 WO 92/08800)。擴增系統(tǒng)的調(diào)查在 Abramson 和 Myers, 1993, Current Opinion inBiotechnology 4:41-47 中提供。基于引物的擴增反應(yīng)的特異性在很大程度上依賴引物雜交和延伸的特異性。在典型擴增中使用的高溫下，引物僅與預(yù)期靶序列雜交。然而，擴增反應(yīng)混合物通常在室溫下組合，遠低于確保引物雜交特異性所需的溫度。在此類較不嚴(yán)格的條件下，引物可以與其他僅部分互補的核酸序列或與其他引物非特異性結(jié)合，并且起始不希望的延伸產(chǎn)物的合成，其可以沿靶序列擴增。非特異性引物延伸產(chǎn)物的擴增可以與所需靶序列的擴增競爭，并且可以顯著降低所需序列的擴增效率。一種經(jīng)常觀察到的類型的非特異性擴增產(chǎn)物是被稱為“引物二聚體”的模板不依賴性擴增反應(yīng)假象(artifact)。引物二聚體是這樣的雙鏈片段，其長度通常接近于兩條引物長度總和，并且看起來當(dāng)一條引物在另一條引物上延伸時發(fā)生。所得到的延伸產(chǎn)物形成不希望的模板，因為其短長度，所以所述不希望的模板被有效擴增。非特異性擴增可以通過在反應(yīng)開始前降低引物延伸產(chǎn)物形成而降低。在被稱為“熱啟動”方案的一種方法中，一種或多種關(guān)鍵試劑從反應(yīng)混合物中扣留，直至溫度足夠升高以提供所需雜交特異性時。其中反應(yīng)管在初始高溫溫育步驟后打開并加入缺少的試劑的手動熱啟動方法是費力的，并且增加反應(yīng)混合物污染的風(fēng)險。或者，熱敏感材料例如蠟可以用于分開或隔離反應(yīng)組分，如美國專利號5，411，876和Chou等人，1992，Nucl.Acids Res.20 (7):1717-1723中所述。在這些方法中，高溫反應(yīng)前溫育熔化熱敏感材料，由此允許試劑混合。在反應(yīng)開始前降低引物延伸產(chǎn)物形成的另一種方法依賴DNA聚合酶的熱可逆失活。美國專利號5，773，258和5，677，152描述了通過改性劑基團(modifier group)的共價連接可逆修飾的DNA聚合酶。失活的DNA聚合酶在高溫下溫育導(dǎo)致改性劑(modifier)-酶鍵的斷裂，由此使酶再活化。DNA聚合酶通過DNA聚合酶特異性抗體的非共價可逆抑制在美國專利號5，338，671 中描述。非特異性擴增還可以使 用美國專利號5，418，149中描述的方法，通過在反應(yīng)開始前酶促降解形成的延伸產(chǎn)物而降低。新近合成的延伸產(chǎn)物的降解通過下述實現(xiàn):將dUTP和UNG摻入反應(yīng)混合物內(nèi)，并且在進行擴增反應(yīng)前，使反應(yīng)混合物在45-60°C下溫育。引物延伸導(dǎo)致形成含尿嘧啶DNA，其在擴增前條件下由UNG降解。該方法的缺點是延伸產(chǎn)物的降解與延伸產(chǎn)物的形成競爭，并且非特異性引物延伸產(chǎn)物的消除可能是較不完全的。該方法的優(yōu)點是作為來自先前反應(yīng)的污染引入反應(yīng)混合物內(nèi)的含尿嘧啶DNA也被降解，并且因此該方法還降低PCR由來自先前反應(yīng)的擴增核酸污染的問題。在反應(yīng)開始前降低引物延伸產(chǎn)物形成的另一種方法依賴于使用在3’端處或附近通過將基團加入環(huán)外胺(exocyclic amine)而修飾的引物,如美國專利號6，001，611中所述。在本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的分子生物學(xué)和核酸化學(xué)的常規(guī)技術(shù)在文獻中充分說明。參見例如，Sambrook 等人，1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor, New York ；01igonucleotide Synthesis (M.J.Gait,編輯，1984) ；Nucleic Acid Hybridization (B.D.Hames 和 S.J.Higgins.編輯，1984) ；PCRTechnology - principles and applications for DNA amplification, 1989, (H.A.Erlich編輯)Stockton Press, New York ；PCR Protocols: A guide to methods and applications,1990, (M.A.1nnis 等人編輯)Academic Press, San Diego ;和 PCR Strategies, 1995, (M.A.1nnis 等人編輯)Academic Press, San Diego。專利技術(shù)概述 本專利技術(shù)基于令人驚訝的發(fā)現(xiàn):在某些擴增反應(yīng)中，特別是在含有多條引物和探針用于擴增和檢測多種靶核酸的反應(yīng)(例如多重PCR反應(yīng))中，一條或多條探針可能充當(dāng)可能導(dǎo)致非特異性擴增的模板，所述非特異性擴增依次又產(chǎn)生假陽性的信號。為了降低PCR中基于探針的非特異性擴增，可以使用干擾DNA聚合酶活性但仍能夠與互補核苷酸堿基配對的小溝本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
在采用以模板依賴性方式的引物延伸的測定中，防止與模板核苷酸序列雜交的引物寡核苷酸通過DNA聚合酶延伸的方法，其包括將小溝結(jié)合劑摻入所述模板核苷酸序列上，并且其中所述引物寡核苷酸不能被延伸超出N2?芐基?dG核苷酸位置多于2個核苷酸。

【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】2011.12.22 US 61/5793171.在采用以模板依賴性方式的引物延伸的測定中，防止與模板核苷酸序列雜交的引物寡核苷酸通過DNA聚合酶延伸的方法，其包括將小溝結(jié)合劑摻入所述模板核苷酸序列上，并且其中所述引物寡核苷酸不能被延伸超出N2-芐基-dG核苷酸位置多于2個核苷酸。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述小溝結(jié)合劑是經(jīng)修飾的核苷酸。3.權(quán)利要求3的方法，其中所述經(jīng)修飾的核苷酸是N2-芐基-脫氧鳥苷(N2-芐基-dG)。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述測定選自PCR擴增、DNA測序和基因分型。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述測定是PCR擴增。6.降低或防止在擴增反應(yīng)過程中核酸的非特異性擴增的方法，其包括提供能夠擴增靶核酸序列的至少一對引物寡核苷酸；和提供摻入小溝結(jié)合劑的探針寡核苷酸，當(dāng)所述引物寡核苷酸與所述探針寡核苷酸雜交時，所述小溝結(jié)合劑阻斷所述引物寡核苷酸通過DNA聚合酶延伸超出經(jīng)修飾的核...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：V博德普迪，NJ舍恩布倫納，S威爾，
申請(專利權(quán))人：霍夫曼拉羅奇有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：瑞士;CH