一種基于熒光定量PCR檢測CYP2A6全基因缺失的方法技術

本發明專利技術提供一種基于熒光定量PCR檢測CYP2A6全基因缺失的方法，用于非疾病診斷目的。通過分別設計針對于CYP2A6基因和ALB基因的高特異性引物，利用熒光定量PCR技術來快速準確檢測CYP2A6全基因缺失的方法。其中，針對CYP2A6的引物探針組合為:Fp:5’-TCCCACCCTACTCCCTCTCTC-3’；Rp:5’-GGAGGTGAACGCGGGA-3’；Probe:5’-FAM-TGGAGACAGGCCAGGGGGCG-BHQ2-3’。

【技術實現步驟摘要】
—種基于熒光定量PCR檢測CYP2A6全基因缺失的方法
本專利技術涉及一種檢測CYP2A6全基因缺失的方法。
技術介紹
CYP2A6基因是人細胞色素P450基因超家族的一員，其編碼的蛋白為一種重要的代謝酶，參與多種藥物及有毒化合物在人體內的代謝。CYP2A6基因在人群中表現出廣泛的多態性，其中CYP2A6全基因缺失在中國人群中的發生頻率為5% -15%。替加氟以及以替加氟為主要活性成分的化合物是目前臨床上應用最為廣泛的抗嘧啶類藥物，對消化道腫瘤及等多種實體瘤均有良好治療效果。大量研究表明，CYP2A6全基因缺失多態性與S_1和UFT等以替加氟為活性成分的藥物的藥效密切相關。未攜帶該多態性的患者相對于發生基因缺失的患者有更高的藥物應答率和更長的生存時間。此外，CYP2A6全基因缺失多態性與人對尼古丁的依賴性(煙癮)及多種癌癥的易感性都有緊密的聯系。傳統檢測CYP2A6全基因缺失多態性的技術主要是PCR-凝膠電泳。這種方法成本低，重復性好，然而需要多次的PCR后處理，既操作復雜，又容易發生污染而產生假性結果。SmartPCR技術很大程度上彌補了 PCR-凝膠電泳技術的不足之處，可以在短時間內檢測出CYP2A6全基因純合缺失，然而其無法檢測出CYP2A6全基因雜合缺失的樣本?；趯崟r定量PCR技術對基因拷貝數進行定量的方法已成功應用于基因缺失的檢測技術。其基本原理是設計一套引物探針組合來特異性擴增待檢測的目的基因(靶基因)，同時設計一套引物探針組合來擴增一個在人基因組中保持拷貝數高度穩定的基因(內參基因)。在一次實時定量PCR反應中，同時對一個樣本的靶基因和內參基因進行擴增，并通過二者的擴增指標(Ct值)，計算二者拷貝數的比例。在未發生基因缺失的情況(也未發生異常擴增)，靶基因和內參基因的拷貝數比例應該是1:1，即兩種基因在基因組中均以正常二倍體的形式存在；而當靶基因發生雜合缺失的情況下，靶基因與內參基因的拷貝數比例應該是0.5: 1，即內參基因以正常二倍體的形式存在，而靶基因則只呈現出單倍體的狀態；而當靶基因發生純合缺失時，擴增靶基因的引物探針組合不能產生擴增信號，而內參基因的擴增則正常。在進行樣本檢測時，只需將一個未發生基因缺失的樣本作為對照(質控品)，則可以很清楚地判斷待檢測樣本是否發生了基因缺失，以及該缺失是雜合狀態還是純合狀態。然而，該技術至今未見應用于CYP2A6全基因缺失的檢測；其根本原因是CYP2A6基因與CYP2A7基因及CYP2A13基因具有非常高的序列同源性(90%以上)，因而設計一套適宜于熒光定量PCR反應高特異性擴增CYP2A6基因的引物探針組合十分困難。
技術實現思路
本專利技術提供一種基于熒光定量PCR檢測CYP2A6全基因缺失的方法，通過分別設計針對于CYP2A6基因和白蛋白基因(ALB)的高特異性引物，利用熒光定量PCR技術來快速準確檢測CYP2A6全基因缺失的方法。為實現以上專利技術目的，本專利技術的技術方案如下。該檢測方法包括以下環節:(I)基因特異性引物的設計針對CYP2A6基因設計的序列特異性引物探針組合，序列如下:Fp (上游引物):5 ’ -TCCCACCCTACTCCCTCTCTC-3 ’Rp (下游引物):5 ’ -GGAGGTGAACGCGGGA-3，Probe (探針):5 ’ -FAM-TGGAGACAGGCCAGGGGGCG-BHQ2-3 ’針對ALB基因設計的序列特異性引物探針組合，序列如下:Fp (上游引物):5 ’ -TGTTGCATGAGAAAACGCCA-3 ’Rp (下游引物):5 ’ -GTCGCCTGTTCACCAAGGAT-3 ’Probe (探針):5，-HEX-AGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACA-BHQ2-3，其中，FAM 為 6-carboxyfluorescein ；HEX % 6-carboxy-hexachlorof luorescein ；BHQ2 為 Black Hole Quencher-2(2)模板的制備:提取待測樣本的基因組DNA ；(3)實時定量PCR:針對環節⑴中的兩種特異性引物，建立被測樣本的檢測體系:以反應體系總量20 μ L計，在同一個反應體系中，加入CYP2A6基因特異性上游引物250ηΜ-500ηΜ、下游引物250ηΜ_500ηΜ、探針100ηΜ_200ηΜ、以及ALB基因特異性上游引物250ηΜ-500ηΜ、下游引物 250ηΜ_500ηΜ、探針 100nM_200nM、2 XMastermixlO μ L、被測樣本基因組DNA約10-50ng，使用PCR等級的H2O補足體積20 μ L ;(4)結果判定:將配制好的各反應體系在熒光實時定量PCR儀上進行擴增，根據儀器給出的兩基因的擴增指標(Ct值)來進行結果判定。上述擴增過程的最佳擴增參數為:95°C，2~15min，不循環；95°C，5~lOsec，60°C,20-30sec,68°C,20 ~30sec，共計 35 ~40 個循環。對結果的判定分兩種情況進行:第一種情況，若樣本在FAM通道和HEX通道均呈現正常擴增，則根據儀器給出的樣本在兩個通道的Ct值(FAM通道Ct值指代CYP2A6擴增，HEX通道Ct值指代ALB擴增)來判定該樣本的基因型，計算公式如下:Ratio(S) = 2Μ(εgammaρ2Α6)_α(Α?Β)。同時將已通過可靠技術檢測過確定為未攜帶CYP2A6全基因缺失多態性的樣本作為質控品，參照上述Ratio(S)公式求得質控品兩基因的拷貝數比例Ratio(C)，然后進一步求得待測樣本Ratio(C):Ratio(S)的值，即為r值。若r值范圍在0.90~1.10范圍內，則該樣本未攜帶有CYP2A6全基因缺失多態性；若r值范圍在0.5~0.6范圍內，則該樣本為CYP2A6全基因雜合缺失。第二種情況，若樣本在FAM通道沒有擴增，而在HEX通道擴增情況正常，則表明該樣本中沒有CYP2A6基因存在，即該樣本的基因型為CYP2A6全基因純合缺失；第二種情況實際上為第一種情況中的特殊例，即此時樣本的Ratio(S)為無窮大，其r值為O。相應的，本專利技術還提供一種用于熒光定量PCR檢測CYP2A6全基因缺失的試劑盒，當中包括權利要求1中所述的針對CYP2A6基因設計的序列特異性引物探針組合、針對ALB基因設計的序列特異性引物探針組合、以及2XMastermix和H20。具體以試劑盒中的試劑總量20 μ L計，各試劑的較佳用量分別為:CYP2A6基因特異性上游引物250nM-500nM、下游引物250nM_500nM、探針100nM_200nM、以及ALB基因特異性上游引物 250nM-500nM、下游引物 250nM_500nM、探針 100nM_200nM、2 XMastermixlO μ L，H2O補足體積20 μ L。本專利技術的有益效果如下:1.簡單易行。本專利技術中只需一個反應便可以準確檢測出待測樣本的CYP2A6全基因缺失情況。2.避免假性結果產生。在本專利技術中，針對CYP2A6基因設計的特異性引物具有很高的序列特異性，可以完全消除CYP2A7基因及CYP2A13基因序列同源性對PCR反應的干擾；同時沒有PCR本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種基于熒光定量PCR檢測CYP2A6全基因缺失的方法，用于非疾病診斷目的，包括以下環節：(1)基因特異性引物的設計:針對CYP2A6基因設計的序列特異性引物探針組合，序列如下:上游引物:5’?TCCCACCCTACTCCCTCTCTC?3’下游引物:5’?GGAGGTGAACGCGGGA?3’探針:5’?FAM?TGGAGACAGGCCAGGGGGCG?BHQ2?3’針對ALB基因設計的序列特異性引物探針組合，序列如下:上游引物:5’?TGTTGCATGAGAAAACGCCA?3’下游引物:5’?GTCGCCTGTTCACCAAGGAT?3’探針:5’?HEX?AGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACA?BHQ2?3’其中，FAM為6?carboxyfluorescein；HEX為6?carboxy?hexachlorofluorescein；BHQ2為Black?Hole?Quencher?2；(2)模板的制備:提取待測樣本的基因組DNA；(3)實時定量PCR:以反應體系總量20μL計，在同一個反應體系中，加入CYP2A6基因特異性上游引物250nM?500nM、下游引物250nM?500nM、探針100nM?200nM、以及ALB基因特異性上游引物250nM?500nM、下游引物250nM?500nM、探針100nM?200nM、2×Mastermix10μL、待測樣本的基因組DNA10?50ng，H2O補足體積20μL；(4)結果判定:將配制好的反應體系在熒光實時定量PCR儀上進行擴增，根據儀器給出的兩基因的擴增指標進行結果判定。...

【技術特征摘要】
1.一種基于熒光定量PCR檢測CYP2A6全基因缺失的方法，用于非疾病診斷目的，包括以下環節: (1)基因特異性引物的設計: 針對CYP2A6基因設計的序列特異性引物探針組合，序列如下: 上游引物:5 ’ -TCCCACCCTACTCCCTCTCTC-3， 下游引物:5 ’ -GGAGGTGAACGCGGGA-3，探針:5’ -FAM-TGGAGACAGGCCAGGGGGCG-BHQ2-3’ 針對ALB基因設計的序列特異性引物探針組合，序列如下: 上游引物:5 ’ -TGTTGCATGAGAAAACGCCA-3， 下游引物:5 ’ -GTCGCCTGTTCACCAAGGAT-3，探針:5’ -HEX-AGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACA-BHQ2-3’ 其中，FAM 為 6-carboxyfluorescein ；HEX 為 6-carboxy-hexachlorofIuorescein ；BHQ2 為 Black Hole Quencher-2 ； (2)|吳板的制備:提取待測樣本的基因組DNA ； (3)實時定量PCR: 以反應體系總量20 μ L計，在同一個反應體系中，加入CYP2A6基因特異性上游引物250ηΜ-500ηΜ、下游引物250ηΜ_500ηΜ、探針100ηΜ_200ηΜ、以及ALB基因特異性上游引物250...

【專利技術屬性】
技術研發人員：戴鵬高，尋曉潔，陳超，鄒暉，
申請(專利權)人：陜西佰美基因股份有限公司，
類型：發明
國別省市：陜西;61