鱈科鱈魚成分的實時熒光PCR檢測方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及鱈科鱈魚成分的實時熒光PCR檢測方法。首次揭示一種可特異性鑒定鱈科鱈魚成分的引物，所述引物針對含有鱈科鱈魚成分的DNA可發(fā)生特異性擴增，而對沒有鱈科鱈魚成分的DNA不發(fā)生特異性擴增。采用本發(fā)明專利技術(shù)的方法，具有良好的再現(xiàn)性、靈敏度。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
鱈科鱈魚成分的實時熒光PCR檢測方法
本專利技術(shù)涉及物種檢測領(lǐng)域，更具體地，本專利技術(shù)涉及鱈科鱈魚成分的實時熒光PCR檢測方法。
技術(shù)介紹
鱈科鱈魚(Gadidae)屬脊椎動物門(Vertebrata)、真骨魚綱(Teleostei)、鱈形目(Gadiformes) 0鱈魚具有高營養(yǎng)、低膽固醇、易于被人體吸收等優(yōu)點。鱈科鱈魚是最常見的鱈魚種類，有許多經(jīng)濟價值極高的世界級重要經(jīng)濟魚類，已知全世界鱈科鱈魚類有50多種，它們中大多數(shù)分布于大西洋北部大陸架海域；重要魚種有太平洋鱈、大西洋鱈、黑線鱈、藍鱈、綠青鱈、牙鱈、挪威長臂鱈和狹鱈等。世界鱈魚的年產(chǎn)量約占世界魚產(chǎn)量的15-18%。鱈科鱈魚中最主要的狹鱈，主要生產(chǎn)國為蘇聯(lián)、日本、朝鮮及美國等，其次為大西洋鱈，主要生產(chǎn)國有加拿大、冰島、挪威、丹麥、英國、蘇聯(lián)等，我國生產(chǎn)的鱈魚是叫做太平洋鱈魚(俗稱大頭鱈)，我國市面上較常見的鱈魚有大西洋鱈、太平洋鱈、狹鱈、黑線鱈等，大部分屬于鱈科。近些年來市場上鱈魚及其制品的消費逐漸上升，然而過度捕撈和缺乏保護措施，鱈魚的資源量大減，不法商販以低價值魚及其制品代替鱈魚及其制品出售，牟取暴利，一方面大大損害了消費者的利益，另一方面也造成了不正當?shù)纳虡I(yè)競爭。1999年12月17日，歐洲委員會制定了 104/2000號法令，該法令針對的是漁業(yè)、農(nóng)業(yè)產(chǎn)品市場的參與者，法令規(guī)定魚類及其制品除非貼上商品名稱、生產(chǎn)方法和捕獲區(qū)域的標簽，否則該魚類及其制品不能用于零售。該法令強制所有成員國制定并發(fā)布一項名單，名單包括能在商業(yè)上獲得的魚類的俗名和學名。在市場上出售的鱈魚制品中，物種的原始可識別形態(tài)特征消失，這使得物種的鑒別變得相對困難。建立一種可以對鱈科鱈魚DNA進行特異性檢測的準確性高、實用性強的方法非常必要的。 國內(nèi)外學者運用普通PCR方法和實時熒光PCR方法對大西洋鮭、黃鰭金槍魚、長鰭金槍魚、鯊魚等魚類物種鑒定做了大量研究。國外已有研究報道檢測鑒別大西洋鱈魚、太平洋鱈魚、狹鱈等鱈科的某一物種，Beatriz Herrero等用TaqMan實時熒光PCR檢測新鮮、冷藏、加工的產(chǎn)品中的大西洋鱈魚成分。鶴田小百合等根據(jù)cytb基因設(shè)計了特異性引物，建立了 TaqMan實時熒光PCR檢測和鑒定太平洋鱈，阿拉斯加狹鱈的方法。Martin 1.Taylor等建立了實時熒光PCR同時鑒定大西洋鱈，黑線鱈和牙鱈的方法。然而，鑒于鱈科鱈魚難以找到有代表性的檢測手段，目前本領(lǐng)域未見鱈科鱈魚的檢測方法的報道。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供鱈科鱈魚成分的實時熒光PCR檢測方法。在本專利技術(shù)的第一方面，提供一種特異性鑒定鱈科鱈魚成分的方法，所述方法包括:以待測樣品的DNA為模板，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2所示的引物以及SEQ ID NO: 3所示的探針進行實時熒光PCR檢測。在一個優(yōu)選例中，所述的待測樣品是食品、飼料、水產(chǎn)品或遺傳物質(zhì)材料。在另一優(yōu)選例中，所述方法的檢測靈敏度為0.1ng/μ L鱈科鱈魚DNA。在另一優(yōu)選例中，所述的鱈科鱈魚選自:藍鱈(Micromesistius poutassou)、南鍾(mutaenolepis microps)、黑線鍾(Melanogrammus aeglefinus)、狹鍾(Theragrachalcogramma)、青鍾(Pollachius pollachius)、太平洋鍾(Gadus macrocephalus)、大西洋鍾(Gadus macrocephalus)、青綠鍾(Pollachius virens)。在本專利技術(shù)的另一方面，提供一種引物，所述引物是引物對，其序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2 所示。在本專利技術(shù)的另一方面，提供一種探針，所述的探針序列如SEQ ID N0:3所示。在本專利技術(shù)的另一方面，提供所述的引物和/或所述的探針的用途，用于從待測樣品中鑒定鱈科鱈魚成分。 在本專利技術(shù)的另一方面，提供一種鑒定鱈科鱈魚成分的試劑盒，其中包括所述的引物和/或所述的探針。在一個優(yōu)選例中，所述試劑盒中還包括:含有鱈科鱈魚成分的檢測標準品。在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒中還包括選自以下的試劑:DNA提取試劑，Taq酶，PCR緩沖液，DNA聚合酶，和/或說明鑒定鱈科鱈魚成分的方法的使用說明書。本專利技術(shù)的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。【附圖說明】圖1、鱈科鱈魚成分的物種特異性實時熒光PCR檢測圖。1:狹鱈；2:青鱈；3:太平洋鱈；4:大西洋鱈魚；5:青綠鱈；6:藍鱈；7:黑線鱈；8:南鱈。圖2、鱈科鱈魚DNA配比的實時熒光PCR檢測靈敏度圖。I:0.1ng/ μ L 太平洋鱈 DNA ；2:0.1ng/ μ L 大西洋鱈 DNA ；3:0.1ng/ μ L 狹鱈 DNA ；4:0.1ng/ μ L 青綠鱈 DNA ；5:0.1ng/ μ L 青鱈 DNA。圖3、鱈科鱈魚粉重量比的實時熒光PCR檢測靈敏度圖。1:0.01 % 太平洋鱈；2:0.01 % 大西洋鱈；3:0.01 % 狹鱈；4:0.01 % 青綠鱈；5:0.01%青鱈。圖4、實際樣品檢測結(jié)果。【具體實施方式】本專利技術(shù)人經(jīng)過廣泛而深入的研究和試驗，首次揭示一種可特異性鑒定鱈科鱈魚成分(較佳地選自藍鱈、南鱈(mutaenolepis microps)、黑線鱈、狹鱈、青鱈、太平洋鱈、大西洋鱈、青綠鱈)的引物，所述引物針對含有鱈科鱈魚成分的DNA可發(fā)生特異性擴增(獲得陽性結(jié)果)，而對沒有鱈科鱈魚成分的DNA不發(fā)生特異性擴增(獲得陰性結(jié)果)。為了簡化PCR擴增方法，本專利技術(shù)人還設(shè)計了配合所述引物的、用于進行實時熒光PCR的Taqman探針。采用所述的引物配合Taqman探針，可良好地應(yīng)用于鑒定鱈科鱈魚成分，并且具有良好的再現(xiàn)性、靈敏度。鱈魚的品種非常多，鱈形目下包括鱗鰻鱈亞目、鱈亞目、長尾鱈亞目和蛇鐦亞目4亞目11個科約162屬708種。目前常被捕撈的主要包括鱈科、無須鱈科和長尾鱈科的鱈魚。鱈科鱈魚包括有許多經(jīng)濟價值極高的世界級重要經(jīng)濟魚類，已知全世界鱈科鱈魚類有50多種，它們中大多數(shù)分布于大西洋北部大陸架海域；重要魚種有太平洋鱈、大西洋鱈、黑線鱈、藍鱈、綠青鱈、牙鱈、挪威長臂鱈和狹鱈等。鑒于鱈魚種類繁多，從如此多的種類中找到對于鱈科鱈魚特異性的鑒定試劑非常困難。需要考慮的不僅僅是鱈科鱈魚這類物種的基因序列，而是需要考慮不要與其它與之具有親緣關(guān)系的諸多物種產(chǎn)生交叉反應(yīng)，這是非常困難的。例如，澳洲無須鱈、阿根廷無須鱈、南非無須鱈、北太平洋無須鱈為無須鱈科的物種，它們并非鱈科的物種，但要將它們與鱈科鱈魚區(qū)分，目前而言尚缺乏檢測手段。為此，本專利技術(shù)人經(jīng)過了長期的研究和篩選，深入比對鱈科鱈魚物種內(nèi)的保守性和非鱈科鱈魚物種間的差異性，經(jīng)過針對各種樣本的反復(fù)試驗驗證，最終確定了適用于鑒定鱈科鱈魚的特異性引物和探針序列，即SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物以及SEQ IDNO:3所示的探針。如本文所用，所述的“鱈科鱈魚成分”是指特異性來自于鱈科鱈魚(Gadidae)的成分，可以是鱈科鱈魚本身或其加工產(chǎn)品。所述的“鱈科鱈魚(Gadidae) ”是鱈形目(Gadiformes)下面的“鱈科”的物種。較本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種特異性鑒定鱈科鱈魚成分的方法，其特征在于，所述方法包括：以待測樣品的DNA為模板，以SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2所示的引物以及SEQ?ID?NO:3所示的探針進行實時熒光PCR檢測。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種特異性鑒定鱈科鱈魚成分的方法，其特征在于，所述方法包括: 以待測樣品的DNA為模板，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物以及SEQ ID NO:3所示的探針進行實時突光PCR檢測。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的待測樣品是食品、飼料、水產(chǎn)品或遺傳物質(zhì)材料。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的檢測靈敏度為0.1ng/yL鱈科鱈魚 DNA。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的鱈科鱈魚選自:藍鱈(Micromesistius poutassou)、南鍾(mutaenolepis microps)、黑線鍾(Melanogrammusaeglefinus)、狹鍾(Theragra chalcogramma)、青鍾(Pollachius pollachius)、太平洋鍾(Gadus mac...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張舒亞，印麗萍，張坤，樊彥莉，鄭江，陳穎，
申請(專利權(quán))人：上海出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢驗檢疫技術(shù)中心，
類型：發(fā)明
國別省市：上海;31