一種利用ITS序列鑒定當歸及其混偽品的方法技術

本發(fā)明專利技術涉及一種利用ITS序列鑒定當歸及其混偽品的方法。包括以下步驟：1）中藥當歸及其混偽品總DNA的提??；2）以步驟1）中提取的DNA為模板，使用SEQ?ID?NO.1和2所示引物進行PCR擴增反應；3）PCR產物直接測序；4）序列拼接、對比，建立NJ樹，鑒別中藥當歸及其混偽品。本發(fā)明專利技術首次運用ITS序列鑒別中藥當歸及其混偽品，該方法操作簡便、結果顯著、實用性強，可以快速、準確的鑒別開中當歸及其混偽品，適于廣泛推廣應用。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】
—種利用ITS序列鑒定當歸及其混偽品的方法
本專利技術涉及中藥材來源品種鑒定
，具體地，涉及一種利用ITS序列鑒定當歸及其混偽品的方法。
技術介紹
當歸，2010版藥典記載為傘形科植物當歸(Angelica sinensis (Oliv.) Diels.)的干燥根，具有補血活血，調經止痛，潤腸通便。用于血虛萎黃，眩暈心悸，月經不調，經閉痛經，虛寒腹痛，風濕痹痛，跌撲損傷，癰疽瘡瘍，腸燥便秘的功效?，F(xiàn)代藥理也研究表明，當歸在促進造血與抗貧血、抑制血小板聚集、抗血栓、抗凝血、抗氧化、抗炎、抗腫瘤、提高免疫因子活性、神經保護和修復，以及對心腦血管系統(tǒng)的保護都能起到重要的作用。當歸為常用中藥材，在臨床方面有廣泛的用途。當歸屬物種分布廣泛，種類繁多，但由于臨床需求量大，經常出現(xiàn)供不應求的狀況。市場上關于當歸的混偽品主要有重齒毛當歸、土當歸、藁本、紫花前胡等，其形態(tài)類似，參雜在正品當歸中很難鑒別。條形碼技術是一種分子鑒定技術，它利用一段特定的DNA片段，即可實現(xiàn)物種間的鑒別。本專利技術以ITS序列為條形碼，運用生物信息學的方法準確鑒別中藥當歸及其混偽品，為條形碼技術在中藥鑒定中的應用提供理論基礎。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術目的是提供一種利用ITS序列鑒別中藥當歸及其混偽品的分子鑒定方法。具體步驟如下:1)中藥當歸及其混偽品總DNA的提取；2)以步驟I)中提取的DNA為模板，使用ITS4R和ITS5F引物進行PCR擴增反應；3) PCR產物直接測序；4)序列拼接、對比，建立NeighborJoining Tree (NJ樹),鑒別中藥當歸及其混偽品。其中，PCR反應體系以25 μ I計為:ddH20:8.5 μ I2XTaq PCR Mix: 12.5μ IITS4R/5F 引物:1/1 μ IDNA 模板:2μ1pCR 反應條件為:94 °C 5min ；94 °C lmin、50 °C lmin、72 °C 1.5min+3s/cycle,30cycles ；72°C 7min ；建立NJ樹后，可以看到當歸與其混偽品分在不同的支上，通過觀察NJ樹，可以很明顯的把中藥當歸與其混偽品鑒別開。本專利技術首次運用ITS序列鑒別中藥當歸及其混偽品，該方法操作簡便、結果顯著、實用性強，可以快速、準確的鑒別開中當歸及其混偽品，適于廣泛推廣應用。本專利技術提取樣品DNA、ITS序列-PCR擴增、測序，對序列進行拼接、比對，結合網絡數據基于K2P模型對中藥當歸及其混偽品的ITS序列建立Neighbor-Joining Tree (NJ樹)。通過對NJ樹的分析，可以很好的鑒別開中藥當歸及其混偽品。【附圖說明】圖1為使用ITS 4R/5F引物PCR擴增當歸及其混偽品的電泳檢測圖。其中，DG1-DG15為當歸，D1-D6為獨活，XJ1-XJ2為新疆藁本，ZH為紫花前胡，TDG1-TDG4為土當歸，LGB1-LGB6 為遼藁本，XG1-XG8 為西歸；QG1_QG16 為秦歸，QH1-QH7 為羌活，M 為 DNA Marker,CK為空白陰性對照；圖2為基于K2P距離法建立中藥當歸及其混偽品Neighbor Joining Tree (NJ樹)；樣品編號同圖1。圖3為市售中藥當歸10樣品的ITS 4R/5F引物PCR擴增電泳檢測圖；圖4為基于K2P距離法建立市售當歸樣品Neighbor Joining Tree (NJ樹);樣品編號同圖3。圖5為基于K2P距離法建立當歸及其偽品GenBank數據庫ITS序列的NeighborJoining Tree (NJ樹),命名方式為樣品編號+種拉丁名+ITS序列GenBank登錄號。【具體實施方式】以下實施例用于說明本專利技術，但不用來限制本專利技術的范圍。在不背離本專利技術精神和實質的情況下，對本專利技術方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本專利技術的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。 實施例1當歸及其混偽品GenBank數據分析從GenBank上下載當歸及其混偽品ITS序列數據,運用生物信息學軟件CodonCodeAligner和MEGA5進行對比分析,建立Neighbor Joining Tree (NJ樹)，結果如圖5所示，ITS序列可以很好的把當歸及其混偽品分開；實施例2運用ITS序列鑒別當歸及其混偽品1、樣品來源采用的當歸及其混偽品包括當歸、秦歸、獨活、遼藁本、新疆藁本、土當歸、紫花前胡等，分別收集自甘肅、四川、云南、陜西、湖南、北京等地。紫花前胡(Peucedanumdecursiva(Miq.)Franch.&Sav.)> 土當 歸(Levisticum officinale ff.D.J.Koch)>遼藁本(Ligusticum jeholense Nakai et Kitag.)、新疆藁本(Conioselinumvaginatum(Spreng.) Thell.)、重齒毛當歸(Angelica pubescens Maxim, f.biserrata Shanet Yuan)。2、DNA 提取將上述樣品，每個樣品取約30mg，加入滅菌小鋼珠，用磨樣機磨成粉末，利用試劑盒法提取DNA。試劑盒購自TianGen公司，型號為植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)200preps。3、PCR 擴增引物:ITS4R:5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，；ITS 5F:5，-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3，；PCR反應體系以25 μ I計為:ddH20:8.5 μ I2XTaq PCR Mix: 12.5μ IITS4R/5F 引物:1/1 μ IDNA 模板:2 μ IPCR 反應條件為:94 °C 5min ；94 °C lmin、50 °C lmin、72 °C 1.5min+3s/cycle,30cycles ；72°C 7min ；4、測序運用ABI3730測序儀對PCR產物進行直接測序。5、序列拼接、比對、處理運用生物信息學軟件CodonCode Aligener進行序列拼接,MEGA 5進行序列比對、建立NJ樹；結果如圖所示，圖1為當歸及其混偽品ITS序列PCR擴增電泳檢測圖，顯示DNA擴增成功，可以測序；圖2為基于K2P距離法建立的當歸及其混偽品ITS序列NeighborJoining Tree (NJ樹)，由圖可明顯看出當歸與其混偽品都分在不同的支上,可以明顯的鑒別開。實施例3運用 ITS序列鑒別市售當歸樣品1、樣品來源采用的10份當歸樣品搜集自從市場上銷售的中藥當歸。2、DNA 提取將上述樣品，每個樣品取約30mg，加入滅菌小鋼珠，用磨樣機磨成粉末，利用試劑盒法提取DNA。試劑盒購自TianGen公司，型號為植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)200prepso3、PCR 擴增PCR反應體系以25 μ I計為:ddH20:8.5 μ I2XTaq PCR Mix: 12.5μ IITS4R/5F 引物: 1/1 μ IDNA 模板:2 μ IPCR 反應條件為:94 °C 5min ；94 °C lmin、50 °C lmin、72 °C 1.5min+3s/cycle,3本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種鑒定當歸及其混偽品的方法，包括以下步驟：1）提取中藥當歸及其混偽品的總DNA；2）以步驟1）中提取的DNA為模板，使用SEQ??ID??NO.1和2所示引物進行PCR擴增反應；3）PCR產物直接測序；4）序列拼接、對比，建立NJ樹，鑒別中藥當歸及其混偽品。

【技術特征摘要】
1.一種鑒定當歸及其混偽品的方法，包括以下步驟: 1)提取中藥當歸及其混偽品的總DNA；2)以步驟I)中提取的DNA為模板，使用SEQID N0.1和2所示引物進行PCR擴增反應； 3)PCR產物直接測序； 4)序列拼接、對比，建立NJ樹，鑒別中藥當歸及其混偽品。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR反應體系以25μ I計為: ddH20: 8.5 μ I 2...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：黃林芳，鄭司浩，林余霖，陳士林，
申請(專利權)人：中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：北京;11