茄子高溫脅迫內參基因及其應用制造技術

本發(fā)明專利技術公開了茄子高溫脅迫內參基因及其應用。本發(fā)明專利技術基于正常生長條件和高溫脅迫6h條件下的熱敏和耐熱茄子幼苗葉片轉錄組RNA?Seq數(shù)據(jù)，從中找到8個候選內參基因。以SmActin為對照，對8個候選內參基因在熱敏和耐熱茄子品系高溫脅迫不同時間、不用組織的實驗材料中進行實時熒光定量PCR（qPCR）分析，采用GeNorm、NormFinder、Bestkeeper和ReFinder軟件對qPCR結果進行分析，最終得到了在茄子正常生長溫度和高溫脅迫下不同時間和不同組織中最穩(wěn)定表達的3個內參基因—Sm?EF?1A、Sm?TRX、Sm?UCP。本發(fā)明專利技術首次針對茄子耐熱性研究借助RNA?Seq數(shù)據(jù)對內參基因進行篩選，有利于提高茄子高溫脅迫條件下基因表達分析研究的穩(wěn)定性和可靠性。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術屬于農(nóng)業(yè)生物
，具體涉及茄子高溫脅迫內參基因的篩選及其應用。
技術介紹
茄子(SolanummelongenaL.)屬于茄科茄屬蔬菜作物，在世界各地廣泛栽培。茄子生產(chǎn)容易受到高溫脅迫影響(李植良等，2009)。因此，耐熱性資源和基因挖掘是茄子育種的重要目標之一。基于轉錄組測序比較耐熱品種和熱敏品種基因表達差異的研究過程中，較多的涉及到應用q-PCR驗證和分析基因表達模式和水平，因此篩選高溫脅迫條件下穩(wěn)定表達的內參基因對q-PCR結果起著關鍵作用。目前，在茄科作物上常用的內參基因有3–磷酸甘油醛脫氫酶基因(GAPDH)、18S核糖體RNA(18sRNA)、肌動蛋白基因(ACTIN)、多聚泛素酶基因(UBQ)、轉錄延伸因子基因(EF1)、親環(huán)蛋白基因(CYP)和α微管蛋白基因(TUA)等。我們采用RNA-Seq技術研究了熱敏茄子自交系05-1和耐熱茄子自交系05-4高溫脅迫處理前后的基因表達譜，采用q-PCR驗證基因表達水平，以SmActin作為內參基因，發(fā)現(xiàn)SmActin表達會受到高溫脅迫影響較大。因此，目前進行茄子耐熱性相關基因的表達研究工作中最亟待解決的難題是：篩選穩(wěn)定性好的內參基因。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術的一個目的在于提供幾個茄子高溫脅迫條件下基因表達譜中穩(wěn)定表達的基因，以其作為茄子高溫脅迫內參基因。本專利技術所采取的技術方案是：茄子高溫脅迫內參基因，其為茄子轉錄延伸因子EF1A基因、轉錄延伸因子EF2基因、核糖體蛋白RPL24基因、核糖體蛋白RPS29基因、硫氧還蛋白TRX基因、酪蛋白激酶基因、DAHP合酶基因或Unigene0048390基因。所述轉錄延伸因子EF1A基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述轉錄延伸因子EF2基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，核糖體蛋白RPL24基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，核糖體蛋白RPS29基因的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，硫氧還蛋白TRX基因的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，酪蛋白激酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示，DAHP合酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示，Unigene0048390基因的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示。以上所述的茄子高溫脅迫內參基因在茄子耐熱性基因篩選或研究中的應用。用于擴增茄子高溫脅迫內參基因的PCR引物。所述的PCR引物在茄子耐熱性基因篩選或研究中的應用。本專利技術的有益效果是：本專利技術篩選了8個高溫脅迫條件下在茄子基因表達譜中穩(wěn)定表達的基因，以其作為茄子高溫脅迫內參基因，有利于提高茄子高溫脅迫條件下基因表達分析研究的穩(wěn)定性和可靠性。具體實施方式下面結合實施例對本專利技術作進一步的說明，但并不局限于此。實施例1高溫脅迫下茄子內參基因的篩選通過基于RNA-Seq篩選得到熱敏(05-1)和耐熱(05-4)茄子品系自交系幼苗在正常生長溫度和6h高溫脅迫后共4個樣本(05-1CK、05-16h、05-4CK、05-46h、)的22215個Unigene的RPKM值，得到了8個表達穩(wěn)定的Unigene作為候選內參基因(見表1)。表1RNA-Seq中代表各Unigene表達水平的RPKM值針對以上篩選得到的8個候選內參基因，分別設計qPCR引物，其序列如表2所示：表29個茄子內參基因的引物序列實施例2候選內參基因的表達穩(wěn)定性分析1、不同高溫脅迫時間下，候選內參基因在熱敏和耐熱茄子葉片中的表達穩(wěn)定性分析(1)以苗期高溫脅迫鑒定及田間均表現(xiàn)為耐熱的親本自交系05-4和熱敏感的親本自交系05-1為植物材料(孫保娟等，2007；孫保娟等，李植良等，2009)。(2)27℃培養(yǎng)30d左右，當幼苗具有4片真葉時進行42℃高溫高溫脅迫處理不同時間(0h，0.5h，1h，2h，4h，6h，12h，24h)。每個處理10株，設3次生物學重復。以未進行任何高溫處理的材料作為對照。(3)采用Trizol試劑(Invitrogen)進行RNA提取，反轉錄使用M-MML逆轉錄酶(Invitrogen)，利用OligoT15引物進行cDNA的合成，操作步驟均參照公司提供的實驗手冊。將產(chǎn)物稀釋5倍后作為PCR擴增的模板。表達分析采用表2的引物組合，進行實時定量PCR反應，試劑為PremixExTaqTM試劑盒(Bio-RAD)。反應程序：94℃，3min，[94℃20s；56℃，20s，72℃，20s]×40個循環(huán)；溶解曲線程序：65℃加熱至90℃，5s。每次反應要重復三次。PCR完成后，經(jīng)自動分析，查看每個基因的擴增情況，導出相應的域值循環(huán)數(shù)(cycleatthreshold)，即Ct值，詳見表3。表3高溫脅迫不同時間候選內參基因在熱敏和耐熱茄子葉片中平均Ct值(4)對熒光定量PCR反應后得到的Ct值，使用GeNorm、Bestkeeper和Normfinder軟件進行各候選內參基因穩(wěn)定性進行分析。GeNorm軟件計算每個候選基因表達穩(wěn)定度M值，M值越高，表達越不穩(wěn)定。NormFinder軟件結合組內方差與組間方差計算出各候選內參基因穩(wěn)定值，該值越小，表明內參基因越穩(wěn)定。Bestkeeper可以直接輸入Ct值，通過計算標準偏差和變異系數(shù)值的大小比較各內參基因的穩(wěn)定性，標準差和變異系數(shù)越小，穩(wěn)定性越好。從表4可見，基于RNA-Seq得到的8個候選內參基因在茄子高溫脅迫不同時間、不同品種中的表達穩(wěn)定性均優(yōu)于對照SmActin。表4高溫脅迫不同時間候選內參基因在茄子不同品種中的表達穩(wěn)定性(M值)的分析結果2、高溫脅迫下，候選內參基因在茄子不同組織中表達穩(wěn)定性分析(1)分別以茄子耐熱自交系05-4和熱敏感自交系05-1高溫脅迫處理6h及對照的根、莖和葉作為實驗材料。(2)提取RNA、反轉錄，采用表2的引物組進行qPCR分析。得到的Ct值如表5：表5高溫脅迫下候選內參基因熱敏和耐熱茄子不同組織中的平均Ct值(3)對熒光定量PCR反應后得到的Ct值，使用GeNorm、Bestkeeper和Normfinder軟件進行各候選內參基因穩(wěn)定性進行分析，結果如表6。從表6可見，8個候選內參基因在高溫脅迫不同組織中表達穩(wěn)定性均比對照內參基因SmActin好，但從GeNorm分析得到的M值來看，SmRPL24、SmRPS29基因的M值大于1.5，因此，同SmActin一樣，不適宜作為高溫脅迫下茄子不同組織基因表達水平分析的內參基因。表6候選內參基因在茄子不同組織中(M值)表達穩(wěn)定性分析3、候選內參基因表達穩(wěn)定性本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】
茄子高溫脅迫內參基因，其為茄子轉錄延伸因子EF?1A基因、轉錄延伸因子EF2基因、核糖體蛋白RPL24基因、核糖體蛋白RPS29基因、硫氧還蛋白TRX基因、酪蛋白激酶基因、DAHP合酶基因或Unigene0048390基因。

【技術特征摘要】
1.茄子高溫脅迫內參基因，其為茄子轉錄延伸因子EF1A基因、轉錄延伸因子EF2基因、核糖體蛋白RPL24基因、核糖體蛋白RPS29基因、硫氧還蛋白TRX基因、酪蛋白激酶基因、DAHP合酶基因或Unigene0048390基因。
2.根據(jù)權利要求1所述的茄子高溫脅迫內參基因，其特征在于，所述轉錄延伸因子EF1A基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述轉錄延伸因子EF2基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，核糖體蛋白RPL24基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，核糖體蛋白RPS29基因的核苷...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：孫保娟，李植良，龐強強，金慶敏，鐘玉娟，
申請(專利權)人：廣東省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：廣東;44