本發明專利技術公開了一種填充床反應器制備血管緊張素轉化酶（簡稱ACE）抑制肽的方法。將海藻酸鈉與瑞士乳桿菌蛋白酶酶液混勻，用注射器滴入氯化鈣溶液中，固化洗滌瀝干，即得到固定化瑞士乳桿菌蛋白酶；以固定化瑞士乳桿菌蛋白酶為填充床反應器的填充載體，WPC-80濃縮乳清粉為水解底物，進行乳源ACE抑制肽的制備；水解液經中空纖維膜超濾、冷凍干燥后制成ACE抑制肽產品。本發明專利技術降低了ACE抑制肽的生產成本，可實現ACE抑制肽的連續制備。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及，屬于功能性乳制品開發
技術介紹
血管緊張素轉化酶(angiotensin-converting enzyme,簡稱ACE)抑制肽作為一類具有抑制ACE活性的肽類物質，通過抑制ACE的活性，阻礙有升高血壓作用的血管緊張素II的生成，同時抑制具有降血壓作用的血管舒緩激肽的分解，從而使高血壓下降，達到降血壓的功能。目前已有的治療高血壓的血管緊張素轉化酶(ACE)抑制劑有卡托普利、阿拉普利等，這些是化學合成物，吸收排泄速度快，會引起咳嗽，腎臟損傷及血管神經性水腫等副作用，而來源于動物或者植物蛋白的ACE抑制肽，安全可靠。因此，尋找天然的ACE抑制肽則變得非常重要。乳清是生產奶酪的副產物，其再開發是近幾年來的研究熱點。乳清蛋白中包含有許多生物活性肽序列，可以通過發酵或者酶解的手段得到。目前有關從乳清蛋白中酶解得到ACE抑制肽的報到中使用的酶都為游離酶，利用游離酶制備ACE抑制肽存在一定的弊端:(O不能重復利用，難以將產物和酶分離，需要進一步純化；(2)游離酶不易保存，易失活而增加成本等。這一系列弊端使ACE抑制肽的大規模生產存在成本高而不穩定的問題。針對以上ACE抑制肽生產中存在的問題，本專利技術將瑞士乳桿蛋白酶固定化，并且利用了填充床反應器實現乳清ACE抑制肽的連續制備。近年來研究發現瑞士乳桿菌制作的發酵乳具有較強的降血壓功能，主要是因為瑞士乳桿菌蛋白酶能水解蛋白產生多肽，即血管緊張素轉化酶(ACE)抑制肽。瑞士乳桿菌蛋白酶固定化后可以重復利用，將其作為填充床反應器的填充載體可以實現ACE抑制肽的規模制備。填充床反應器，又稱固定床反應器，就是將固定化酶填充于反應器內，制成穩定的柱床，然后以一定的流速通入水解底物，在一定的反應條件下實現酶催化反應，收集水解產物。填充床反應器具有如下優點:高效率、易操作、結構簡單等，它適用于各種形狀的固定化酶和不含固體顆粒、黏度不大的底物溶液。迄今為止，國內外雖然有很多關于ACE抑制肽的機制研究和分離方法研究，但是連續大規模制備ACE抑制肽的研究還是較少見的，本專利技術使用填充床反應器可以實現ACE抑制肽的連續化制備，對乳源ACE抑制肽的生產開發具有一定的經濟價值和現實意義。
技術實現思路
本專利技術的目的:本專利技術的目的是提供。 —種填充床反應器制備血管緊張素轉化酶抑制肽的方法是，將海藻酸鈉與瑞士乳桿菌蛋白酶酶液混勻，用注射器滴入氯化鈣溶液中，固化洗滌浙干，即得到固定化蛋白酶；以固定化瑞士乳桿菌蛋白酶為填充床反應器的填充載體，進行乳源ACE抑制肽的制備；水解液經中空纖維膜超濾，冷凍干燥后制成ACE抑制肽產品。本專利技術的具體步驟如下:( I)海藻酸鈉固定化瑞士乳桿菌蛋白酶將瑞士乳桿菌用液體MRS培養基37°C培養16-24h。4°C，4500r/min，離心20min，收集瑞士乳桿菌菌體，并洗滌三次。取瑞士乳桿菌菌體，用PH7.8Tris-HCl緩沖液重新懸浮，菌體與緩沖液比例為Ig:30mL，攪勻后在300W，破碎時間3s，間隔時間5s的超聲波破碎條件下破碎200次。將破碎液于4°C，4500r/min，離心20min，取上清液即為瑞士乳桿菌蛋白酶液。在30mL瑞士乳桿菌蛋白酶液(蛋白含量為8mg/mL)中加入0.6g海藻酸鈉，37°C水浴攪拌混勻。4°C條件下靜置備用。用IOmL注射器吸取混合液，以15cm左右高度滴入0.lmol/L的氯化鈣溶液中，立即成球。4°C條件下靜置4h，洗滌浙干，得到固定化瑞士乳桿菌蛋白酶。(2)海藻酸鈉固定化瑞士乳桿菌蛋白酶填充床反應器的制備把固定化瑞士乳桿菌蛋白酶和乳清蛋白溶液(質量濃度5g/100mL的WPC-80濃縮乳清粉)充分混合后裝入1.2cmX80cm的填充柱，具體裝置見圖1。固定化瑞士乳桿菌蛋白酶和乳清蛋白溶液先于填充柱中靜置水解8h，然后開啟恒流泵實現連續式水解，流速為3.2mL/h，連續收集2d。(3)乳源ACE抑制肽的超濾 選用截留分子量為6000Da的中空纖維超濾膜進行超濾，料液溫度為37°C，超濾壓力為0.05Mpa，超濾液進行冷凍干燥后即得到ACE抑制肽產品。本專利技術的有益效果:本專利技術提供了，采用固定化瑞士乳桿菌蛋白酶作為填充床載體，可以重復利用，而且方便產物的分離，從而可以降低生產成本及實現ACE抑制肽的連續化及規?；苽?。乳源性ACE抑制肽雖然其效果不及藥物，但其具備天然、無毒副作用的特點無疑是控制血壓的更佳選擇。乳源ACE抑制肽可添加到奶粉、酸奶、麥片等日常食物中，也可以制成片劑或口服液滿足不同人群的需要，長期服用可以起到預防和輔助治療高血壓疾病及其并發癥的作用。所以本專利技術的研究不僅存在著巨大的市場潛力，并且對提高國民健康素質有重要作用。附圖說明圖1為填充床反應器連續制備ACE抑制肽的設備示意圖(注:1-層析柱(37°C恒溫)；2_水解底物；3_填充載體；4_恒流泵；5_塑料管；6_水解產物；7_水解底物；8_鐵架臺)。圖2A為奶粉濃度對ACE抑制肽蛋白含量和ACE抑制率的影響。圖2B為乳清粉濃度對ACE抑制肽蛋白含量和ACE抑制率的影響。圖3為前靜止水解時間對ACE抑制肽蛋白含量和ACE抑制率的影響。圖4A為填充床流速對ACE抑制肽蛋白含量的影響。圖4B為填充床流速對和ACE抑制肽ACE抑制率的影響。具體實施方式下面通過具體實施例對本專利技術的技術方案做進一步說明，常規的瑞士乳桿菌均可用于本專利技術，下面實施例所用的具體菌株，是為了舉例說明本專利技術，不是對本專利技術技術方案的限制。本專利技術的保護范圍不限于此。1.材料與設備1.1主要材料與試劑海藻酸鈉固定化瑞士乳桿菌蛋白酶實驗室制備；脫脂奶粉光明乳業股份有限公司；WPC-80濃縮乳清粉濃縮蛋白粉美國HILMAR公司；其它試劑南京化學試劑有限公司。1.2主要設備LRH-250A生化培養箱廣東省醫療器械廠；CL_22M高速冷凍離心機賽特湘儀離心機有限公司；754紫外可見分光光度計上海光譜儀器有限公司；填充柱(1.2cm*80cm)上海煊盛儀器有限公司；HH-Sll-2電熱恒溫水浴鍋北京長安科學儀器廠；DHL-A電腦恒流泵上海滬西分析儀器廠有限公司；實驗用膜分離設備上海摩速科學器材有限公司。1.3本專利技術填充床反應器連續制備ACE抑制肽的設備如圖1，由層析柱I ;水解底物2 ;填充載體3 ;恒流泵4 ;塑料管5 ;水解產物6 ;水解底物7 ;鐵架臺8構成。2實驗方法2.1海藻酸鈉固定化瑞士乳桿菌蛋白酶將瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus ATCC15009)用液體 MRS 培養基(蛋白胨10g，牛肉浸膏10g，酵母浸膏5g，葡萄糖20g，吐溫-801g，磷酸氫二鉀2g，無水乙酸鈉5g，檸檬酸三銨2g，水 合硫酸鎂0.5g，水合硫酸錳0.05g,蒸餾水1L，121°C高溫滅菌20min)37°C培養16_24h。4°C，4500r/min，離心20min，收集瑞士乳桿菌菌體，并洗滌三次。取瑞士乳桿菌菌體，用PH7.8Tris-HCl緩沖液重新懸浮，菌體與緩沖液比例為Ig: 30mL,攪勻后在300W，破碎時間3s，間隔時間5s的超聲波破碎條件下破碎200次。將破碎液于4°C，4500r/min,離心20min,取上清液即為瑞士乳桿菌蛋白酶液。在30m本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種填充床反應器制備血管緊張素轉化酶抑制肽的方法，其特征在于，包括以下步驟:（1）海藻酸鈉固定化瑞士乳桿菌蛋白酶將瑞士乳桿菌用液體MRS培養基37℃培養16?24h，4℃，4500r/min，離心20min，收集瑞士乳桿菌菌體，并洗滌三次，取瑞士乳桿菌菌體，用pH?7.8?Tris?HCl緩沖液重新懸浮，菌體與緩沖液比例為1g：30mL，攪勻后在300W，破碎時間3s，間隔時間5s的超聲波破碎條件下破碎200次，將破碎液于4℃，4500r/min，離心20min，取上清液即為瑞士乳桿菌蛋白酶液；????在30mL蛋白含量為8mg/mL的瑞士乳桿菌蛋白酶液中加入0.6g海藻酸鈉，37℃水浴攪拌混勻，4℃條件下靜置備用，用注射器吸取混合液，以15cm高度滴入0.1mol/L的氯化鈣溶液中，立即成球，4℃條件下靜置4h，洗滌瀝干，得到固定化瑞士乳桿菌蛋白酶；（2）海藻酸鈉固定化瑞士乳桿菌蛋白酶填充床反應器的制備把固定化瑞士乳桿菌蛋白酶和乳清蛋白溶液充分混合后裝入填充柱中；固定化瑞士乳桿菌蛋白酶和乳清蛋白溶液先于填充柱中靜置水解8h，然后開啟恒流泵實現連續式水解，流速為3.2mL/h，連續收集2d；3）乳源ACE抑制肽的超濾選用截留分子量為6000Da的中空纖維超濾膜進行超濾，料液溫度為37℃，超濾壓力為0.05Mpa，超濾液進行冷凍干燥后即得到ACE抑制肽產品。...
【技術特征摘要】
1.一種填充床反應器制備血管緊張素轉化酶抑制肽的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)海藻酸鈉固定化瑞士乳桿菌蛋白酶 將瑞士乳桿菌用液體MRS培養基37°C培養16-24h，4°C，4500r/min,離心20min，收集瑞士乳桿菌菌體，并洗滌三次，取瑞士乳桿菌菌體，用pH 7.8 Tris-HCl緩沖液重新懸浮，菌體與緩沖液比例為Ig:30mL，攪勻后在300W，破碎時間3s，間隔時間5s的超聲波破碎條件下破碎200次，將破碎液于4°C，4500r/min，離心20min，取上清液即為瑞士乳桿菌蛋白酶液； 在30mL蛋白含量為8mg/mL的瑞士乳桿菌蛋白酶液中加入0.6g海藻酸鈉,37°C水浴攪拌混勻，4°C條件下靜置備用，用注射器吸取混合液，以15cm高度滴入0.lmol/L的氯化鈣溶液中，立即成球，4° C條件下靜置4h，洗滌浙干，得到固定化瑞士乳桿菌蛋白酶；...
【專利技術屬性】
技術研發人員：郭宇星，
申請(專利權)人：南京師范大學，
類型：發明
國別省市：
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