一種豌豆分離蛋白酶解制備抗氧化肽的方法及應用，屬于食品添加劑技術領域。本發明專利技術涉及以豌豆分離蛋白為原料，抗氧化性以DPPH自由基清除率為指標，優選出胰蛋白酶和中性蛋白酶組合分步酶解方案，得到豌豆蛋白水解產物PPH即抗氧化多肽粗品。該粗品PPH經SephadexG-25凝膠層析和兩次RESOURCETM3RPC反相層析純化獲得高純度的高抗氧化活性肽，濃度在0.2mg/mL時對DPPH自由基清除率達62.03%，與同濃度下谷胱甘肽對DPPH的清除率相近。反相高效液相(RP-HPLC)分析型色譜測定其純度，超高效液相色譜-質譜法(Q-TOF-MS)分析鑒定其氨基酸序列。經脫鹽后的PPH以不同添加量加到潤膚霜中，經測定具有良好的穩定性和抗氧化能力。
【技術實現步驟摘要】
一種豌豆蛋白酶解制備抗氧化肽的方法及應用，屬于生物制品分離純化、食品添加劑
技術介紹
對植物蛋白的開發利用，可從營養和功能特性兩方面綜合考慮，營養特性是基礎，功能特性決定著蛋白質資源的真正利用價值。通過對植物蛋白進行加工開發其功能特性，是提高蛋白質價值的一種有效手段。利用酶解技術加工植物蛋白生產生物活性肽，可應用于食品、醫藥、保健品及化妝品等領域中。豌豆作為一種傳統的豆類作物，在我國擁有相當豐富的資源，存在著極大的開發潛能。國內目前對于豌豆的綜合利用和深加工仍處于起步階段，豌豆主要被許多廠家作為制作粉絲的原料，其主要是利用豌豆中的富淀粉含量來加工成粉絲，而剩下的膳食纖維和蛋白質等常用作飼料，這降低了豌豆的利用價值，因此需要提高豌豆功能特性方面的開發。豌豆蛋白的酶解產物中存在的生物活性肽，因其對人體具有多方面有益的生理功能，具有在食品加工、保健食品、醫藥等領域的開發潛力，可提高豌豆的利用率與使用價值，擴大豌豆的應用前景。抗氧化劑是維持食品原有質量和人體抗氧化防御系統動態平衡的物質基礎，因此獲取抗氧化劑顯得非常重要。化學合成和自然存在的物質都具有抗氧化能力，化學抗氧化劑一般具有較高的有效性和很好的經濟效益，然而安全性得不到保證，具有一定的毒性，只能在一定范圍內使用。來自食物中的天然抗氧化劑雖然一般不及人工合成的高效，可是天然抗氧化劑沒有劑量的限制，當達到一定濃度時可與化學抗氧劑等效，天然抗氧化劑安全無毒，對人體不存在副作用，現在已成為研`究開發的熱點，越來越多的人們傾向于選擇天然抗氧化劑。存在于蛋白質中的一些多肽具有抗氧化能力，自從第一次報告提出以來，越來越多的國內外學者對其進行廣泛的研究。抗氧化肽安全高效，容易被人體吸收、分子量小、結構簡單，在不同環境下保持穩定，不存在免疫排斥反應，除抗氧化性外還可作為機體的營養物質。因此，可以確信在食品、醫藥、人類健康等領域，采用酶法制備抗氧化肽是開發天然、安全、營養的抗氧化劑的一個重要方向。
技術實現思路
本專利技術目的是一種豌豆蛋白酶解制備抗氧化肽的方法及應用，優選出胰蛋白酶和中性蛋白酶組合分步酶解方案，得到抗氧化多肽粗品即豌豆蛋白水解產物PPH。PPH經凝膠層析和反相層析純化獲得高純度的高抗氧化活性肽，液質聯用分析推測其氨基酸序列。對PPH進行放大制備工藝與應用探究，選用超濾膜除大分子物質，納濾膜進行脫鹽濃縮處理，以不同添加量加到潤膚霜中，經測定具有良好的穩定性和抗氧化能力，初步探明該豌豆抗氧化肽在功能型化妝品中的應用潛力。本專利技術的技術方案:一種豌豆蛋白酶解制備抗氧化肽的方法，以豌豆分離蛋白為原料，抗氧化性以DPPH自由基清除率為指標，優選出胰蛋白酶和中性蛋白酶組合分步酶解方案，得到豌豆蛋白水解產物PPH即抗氧化肽粗品。該粗品PPH經S印hadex G-25凝膠層析和兩次RESOURCE 3RPC反相層析純化獲得高純度的高抗氧化活性肽，步驟為: A豌豆分離蛋白酶解制備抗氧化肽 (O原料預處理:以豌豆分離蛋白為原料，配置質量濃度為7.5%的豌豆分離蛋白水溶液，90°C水浴15 min進行預處理，冷卻備用； (2)胰蛋白酶酶解:隨后放在恒溫磁力攪拌器上，溶液邊攪拌邊調至溫度40°C、pH10，按照酶底比E/S為6%加入胰蛋白酶，胰蛋白酶酶活為4 X IO4 U/g,開始水解反應，隨時滴加2M NaOH溶液保持酶解液pH 10不變，充分酶解反應4 h后，煮沸15 min滅酶； (3)中性蛋白酶酶解:步驟(2)產物冷卻后按50°C、pH7.5,E/S為6%加入中性蛋白酶，中性蛋白酶酶活為IXlO5 U/g，水解4 h，煮沸滅酶，冷卻后用2 M HCl溶液調pH 7 ； (4)離心:步驟(3)產物按照8000r/min離心15 min去沉淀，所得上清液為豌豆蛋白水解產物PPH,即抗氧化肽粗品； B酶解豌豆抗氧化活性肽的分離純化及鑒定方法 (5)對PPH凍干樣選用SephadexG-25進行分離,規格為1.6 cmX60 cm,配置濃度50mg/mL，加樣量為2 mL，以純水為洗脫劑，流速為1.5 mL/min，在280 nm處檢測吸光度，在相同濃度下檢測各峰 DPPH自由基的清除能力；收集抗氧化活性較高的峰組分，冷凍干燥； (6)選出抗氧化性高的一組分在AKTA蛋白質分析純化儀上進行反相色譜純化，樣品溶解于含有0.05% (v/v)三氟乙酸TFA的水溶液中，選用RESOURCE 3RPC色譜柱，進樣量為I mL，以2 mL/min的流速用含5%乙腈和0.05%TFA的水溶液A進行洗脫，檢測波長為215nm,使用自動收集器收集洗脫峰；5 min后，以流速為3 mL/min進行梯度洗脫,20 min時達到100%溶液B，溶液B為含60%乙腈和0.05%TFA的水溶液，每管5 mL進行收集；富集的樣品進行旋轉蒸發、冷凍干燥后測各組分的DPPH清除能力； (7)選出DPPH清除率高的組分再一次進行反相層析，溶液C為:含10%乙腈和0.05%TFA的水溶液；溶液D為:含50%乙腈和0.05%TFA的水溶液；其他條件保持不變；按峰收集樣品，旋轉蒸發、冷凍干燥成粉末，檢測各峰的DPPH清除能力，選出活性最高的峰進行冷凍干燥；當濃度在0.2 mg /mL時，對DPPH的清除率達到62.03%，接近于同濃度下生物體內存在的抗氧化肽GSH對DPPH的清除能力66.42%，有很強的抗氧化性。(8)利用RP-HPLC分析型色譜測定純化后的豌豆抗氧化肽樣品，在9.436 min時出現一個比較純的洗脫峰，純度達到90.12% ;經液質聯用分析推測出相對分子量為956.5Da,氛基酸序列為 Phe-Glu-Gly-Met-Thr-Phe-Leu-Leu。結果如圖 2。用所述方法制備的抗氧化肽的應用，對所得PPH選用超濾膜除大分子物質，納濾膜對PPH粗品進行脫鹽濃縮處理，脫鹽率達到79.87%，PPH濃縮2.86倍，納濾過后蛋白損失率為12.15% ;隨后以不同添加量加到潤膚霜中，經測定具有良好的穩定性和抗氧化能力。(I)納濾脫鹽:豌豆蛋白雙酶酶解生成豌豆蛋白水解產物PPH選用PES 10000超濾膜，在操作壓力為0.2 MPa下進行除沉淀和大分子物質，分子量<10 KDa透過液進行PES500納濾脫鹽，測定Cl—離子濃度和根據雙縮脲法測定多肽濃度，在室溫，操作壓力為0.5MPa條件下，進行預濃縮，期間測定Cl—離子濃度，計算脫鹽率；隨后加入純水，繼續進行除鹽，如此反復操作三次。最終脫鹽率可達到79.87%，PPH濃縮了 2.86倍；測定抗氧化肽濃度，由納濾前的8.57 mg/mL變為濃縮后的21.51 mg/mL，納濾過后蛋白損失率為12.15% ;對納濾前后的樣品在不同濃度下進行DPPH清除能力的測定并計算IC5tl值，納濾后的樣品IC5tl值為2.53 mg/mL,而納濾前為2.89 mg/mL, PPH經過納濾脫鹽處理對DPPH清除能力沒有下降； (2)用于制作潤膚霜:將納濾脫鹽后的樣品進行冷凍干燥用于潤膚霜的制作，按0%、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%的添加量分別加入到水相中，再與油相混合，即得抗氧化肽潤膚霜；觀察到分別在_18°C和48本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種豌豆分離蛋白酶解制備抗氧化肽的方法，其特征在于以豌豆分離蛋白為原料，抗氧化性以1,1?二苯基?2?三硝基苯肼DPPH自由基清除率為指標，優選出胰蛋白酶和中性蛋白酶組合分步酶解方案，得到豌豆蛋白水解產物PPH，即抗氧化肽粗品；該粗品PPH經Sephadex?G?25凝膠層析和兩次RESOURCETM?3RPC反相層析純化獲得高純度的高抗氧化活性肽，步驟為：A豌豆分離蛋白酶解制備抗氧化肽（1）原料預處理：以豌豆分離蛋白為原料，配置質量濃度為7.5%的豌豆分離蛋白水溶液，90℃水浴15?min進行預處理，冷卻備用；（2）胰蛋白酶酶解：隨后放在恒溫磁力攪拌器上，溶液邊攪拌邊調至溫度40℃、pH?10，按照酶底比E/S為6%加入胰蛋白酶，胰蛋白酶酶活為4×104?U/g，開始水解反應，隨時滴加2?M?NaOH溶液保持酶解液pH?10不變，充分酶解反應4?h后，煮沸15?min滅酶；（3）中性蛋白酶酶解：步驟（2）產物冷卻后按50℃、pH?7.5，E/S為6%加入中性蛋白酶，中性蛋白酶酶活為1×105?U/g，水解4?h，煮沸滅酶，冷卻后用2?M?HCl溶液調pH?7；（4）離心：步驟（3）產物按照8000?r/min離心15?min去沉淀，所得上清液為豌豆蛋白水解產物PPH，即抗氧化肽粗品；B?酶解豌豆抗氧化活性肽的分離純化及鑒定方法（5）對PPH凍干樣選用Sephadex?G?25進行分離，規格為1.6?cm×60?cm，配置濃度50?mg/mL，加樣量為2?mL，以純水為洗脫劑，流速為1.5?mL/min，在280?nm處檢測吸光度，在相同濃度下檢測各峰DPPH自由基的清除能力；收集抗氧化活性較高的峰組分，冷凍干燥；（6）選出抗氧化性高的一組分在AKTA蛋白質分析純化儀上進行反相色譜純化，樣品溶解于含有0.05%?(v/v)?三氟乙酸TFA的水溶液中，選用RESOURCETM?3RPC色譜柱，進樣量為1?mL，以2?mL/min的流速用含5%乙腈和0.05%TFA的水溶液A進行洗脫，檢測波長為215?nm，使用自動收集器收集洗脫峰；5?min后，以流速為3?mL/min進行梯度洗脫，20?min時達到100%溶液B，溶液B?為含60%乙腈和0.05%TFA的水溶液，每管5?mL進行收集；富集的樣品進行旋轉蒸發、冷凍干燥后測各組分的DPPH清除能力；（7）?選出DPPH清除率高的組分再一次進行反相層析，溶液C為：含10%乙腈和0.05%TFA的水溶液；溶液D為：含50%乙腈和0.05%TFA的水溶液；其他條件保持不變；按峰收集樣品，旋轉蒸發、冷凍干燥成粉末，檢測各峰的DPPH清除能力，選出活性最高的峰進行冷凍干燥；當濃度在0.2?mg?/mL時，對DPPH的清除率達到62.03%，接近于同濃度下生物體內存在的抗氧化肽GSH對DPPH的清除能力66.42%，有很強的抗氧化性；（8）利用RP?HPLC分析型色譜測定純化后的豌豆抗氧化肽樣品，在9.436?min時出現一個比較純的洗脫峰，純度達到90.12%；經液質聯用分析推測出相對分子量為956.5?Da，氨基酸序列為Phe?Glu?Gly?Met?Thr?Phe?Leu?Leu。...
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：田亞平，張秋萍，周鋒，周楠迪，
申請(專利權)人：江南大學，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。