天然人促紅細胞生成素類似物制造技術

本發明專利技術涉及一種具有至少一個額外糖基化位點的促紅細胞生成素類似物或其變體。本發明專利技術還涉及編碼該促紅細胞生成素類似物或其變體的DNA序列，以及供該類似物或其變體表達的重組質粒和宿主細胞。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于基因工程
，具體地說涉及一種具有至少一個額外糖基化位點的促紅細胞生成素類似物或其變體。本專利技術還涉及編碼所述促紅細胞生成素類似物或其變體的DNA序列，以及表達該類似物或其變體的重組質粒和宿主細胞。
技術介紹
促紅細胞生成素(erythropoietin, ΕΡ0)是第一個被發現并應用于臨床的造血生長因子。早在1906年，Carnot等發現兔失血后會在外周血中產生一種可作用于造血系統以加速紅細胞生成的物質，由此提出存在一種體液因子以反饋方式調節血細胞生成。時隔30多年以后此觀點才得以證實，這種因子被命名為促紅細胞生成素。促紅細胞生成素又稱血細胞生成素、紅細胞 刺激因子，屬酸性糖蛋白，是調節前體紅細胞增殖、分化以及保持外周血中紅細胞濃度處于正常生理范圍內的最主要激素。它可與紅細胞前體細胞表面的EPO受體結合，促進其血紅蛋白的合成使之增殖分化成紅細胞，從而調節體內紅細胞和血紅蛋白的生理平衡。EPO是一個強有力的造血生長因子，體外分析顯示在0.05 lU/ml的濃度時即具有劑量依賴效應。EPO可刺激紅系祖細胞(BFU-E)和早幼稚紅細胞(CFU-E)形成成熟的紅細胞集落。EPO除了作用于骨髓巨核前體細胞外，對其他造血細胞均無作用，是迄今認為作用最單一的造血生長因子。當然，對紅細胞造血過程的完整調節，除了 EPO外，還需要其他因子的協同作用，包括Mult1-CSF、GM-CSF和IL-1，這些因子促使干細胞變成BFU-E，并聯合刺激使紅細胞早期增殖，隨后才是EPO的增殖作用。1977年，Miyake等從重癥再障貧血病人的尿中提取得到了 EPO的純品，由于起始來源的匱乏，很難得到大量純品以充分研究其生物學和分子學性質。1984年，科學家們首次以人腎癌細胞的EPO mRNA為模板，經逆轉錄合成cDNA并在大腸桿菌中得以克隆并表達，在此基礎上獲得了 EPO的完整基因并在真核細胞中進行高效表達，為深入研究EPO的生物學效應并將之應用于臨床奠定了基礎。現在國內外已能用基因工程方法生產重組人紅細胞生成素(rhEPO)，并用于臨床治療多種紅細胞減少癥，具有很好的療效。真核細胞產生的許多細胞表面蛋白和分泌蛋白，都被一個或更多寡糖基團修飾。這種稱為糖基化的修飾能強烈影響蛋白質的理化性質，對蛋白質的穩定性、分泌和亞細胞定位也會起重要作用。正確的糖基化有時是生物活性所必需的。某些真核生物的基因在缺乏使蛋白糖基化的細胞過程的細菌(如大腸桿菌)中表達，所回收到的蛋白由于缺乏糖基化而沒有或幾乎沒有活性。糖基化作用出現在多肽骨架的特異位置，通常有兩類:0連接糖基化和N連接糖基化。O連接的寡糖連在絲氨酸或蘇氨酸殘基上，而N連接的寡糖則連接在作為序列Asn-X-Ser/Thr 一部分的天冬酰胺殘基上，其中X可以是除脯氨酸以外的任何氨基酸。N連接和O連接的寡糖結構及每種類型中存在的糖殘基都是不同的。共同存在于兩種類型中的一類糖是N-乙酰基神經氨酸(以下簡稱唾液酸)。唾液酸通常是N連接和O連接寡糖的末端殘基，由于它帶負電荷，可能會使糖蛋白具有酸性。成熟的EPO由166個氨基酸組成，氨基酸序列參見SEQ ID NO: 1，肽鏈結構見圖1。EPO分子內有兩個二硫鍵，3個N-鍵糖基化位點和I個O-鍵糖基化位點，其中兩個二硫鍵在變性EPO復性并折疊成有生物活性構型時是必不可少的。天然人促紅細胞生成素和哺乳動物細胞表達的人促紅細胞生成素都含有三個N連接寡糖鏈和一個O連接寡糖鏈，它們共占蛋白總分子量的40%。N連接糖基化出現在24、38、83位的天冬酰胺殘基，而O連接糖基化則出現在 126 位的絲氨酸殘基(Lai 等,J.Biol.Chem.261:3116,1986 ；Broundy 等，Arch.Biochem.Biophys.265:329,1988))。已證明寡糖鏈被末端唾液酸殘基修飾。對糖基化促紅細胞生成素進行酶處理而脫除唾液酸殘基后，導致體內活性喪失，但不影響體外活性(Lowy等，Naturel85:102,1960 ；Goldwasser 等，J.Biol.Chem.249:4202,1974)。這一現象曾被解釋為無唾液酸促紅細胞生成素由于與肝無唾液酸糖蛋白結合蛋白相互作用而從循環中迅速清除(Morrell 等，J.Bi0.Chem.243:155,1968 出riggs等Am.J.Physiol.227:1385，1974 ；AshwelI,Methods Enzymo1.50:287,1978)。因此促紅細胞生成素只有在被唾液酸酸化從而避免被肝結合時才具有體內生物活性。在促紅細胞生成素的寡糖中，其作用還不十分確定。已證明，部分脫糖基化的促紅細胞生成素與糖基化形式相比，體內活性大大降低，但保留了體外活性(Dordal等，Endocrinologyl 16:2293,1985)。但另一項研究則表明，如果使作為糖基化位點的天冬酰胺或絲氨酸殘基發生突變，從而單獨或共同脫除N連接或O連接的寡糖鏈，則會使在哺乳動物細胞中產生的突變蛋白的體外活性急劇下降(Dube等，J.Biol.Chem.263:17516，1988)。糖蛋白如促紅細胞生成素，可以用諸如等電聚焦(IEF)等技術分離成不同帶 電形式。粗制及部分純化的促紅細胞生成素制備物的IEF研究已有多方報道(Lukosky等，J.Biochem.50:909,1972 ；Shelton 等，Biochem.Med.12:45,1975 ；Fuhr 等，Biochem.Biophys.Res.Comm.98:930,1981)。在Miyake等人所討論的從人尿純化人促紅細胞生成素中，通過羥基磷灰石色譜法得到的兩個促紅細胞生成素組分。這兩個組分被定名為I1、IIIA。隨后對II和III A進行的碳水化合物分析表明，組分II的唾液酸含量比組分III A高。進一步研究還表明，一個位點的糖基化程度很大程度上取決于其周圍氨基酸的組成(Kasturi 等，Biochem.J.323:415，1997 ；Elliott 等，JBC.279:16854，2004)，因此，改變N-糖基化位點附近氨基酸組成會在很大程度上影響糖基化的程度。增加促紅細胞生成素碳水化合物的數目，并因此而增加每個促紅細胞生成素分子的唾液酸數目，可以產生一些優越的性質，例如溶解度提高、更耐受蛋白水解作用、免疫原性下降、血清半衰期延長、生物活性提高。本專利技術通過突變天然EPO序列中的若干個氨基酸殘基增加N-糖基化位點數而提高了 EPO類似物的性能。
技術實現思路
本專利技術涉及一種具有促紅細胞生成素活性的天然人促紅細胞生成素類似物或其變體，該類似物包括至少一個額外N-糖基化位點，其位點范圍位于人促紅細胞生成素氨基酸序列的1-9，28-32，40-55，86-92，112-133，162-166位，以及該變體在該類似物的氨基酸序列中具有一個或幾個氨基酸的缺失、替換或添加，且具有該類似物等同的活性。在一優選的實施方案中，額外N-糖基化位點位于人促紅細胞生成素氨基酸序列的1-6，28-32，87-90位。在另一優選的實施方案中，額外N-糖基化位點的數為1-3個。在另一優選的實施方案中，本專利技術的類似物在天然人促紅細胞生成素氨基酸序列的2、3本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種具有促紅細胞生成素活性的天然人促紅細胞生成素類似物，該類似物包括1個額外N?糖基化位點，其中在天然人促紅細胞生成素氨基酸序列的第3位置換上了天冬酰胺，第4位置換上了苯丙氨酸，第5位置換上了絲氨酸；即[Asn3Phe4Ser5]EPO；所述的額外N?糖基化位點是氨基酸序列第3位的天冬酰胺。

【技術特征摘要】
1.一種具有促紅細胞生成素活性的天然人促紅細胞生成素類似物，該類似物包括I個額外N-糖基化位點，其中在天然人促紅細胞生成素氨基酸序列的第3位置換上了天冬酰胺，第4位置換上了苯丙氨酸，第5位置換上了絲氨酸；即[Asn3Phe4Ser5JEPO ;所述的額外N-糖基化位點是氨基酸序列第3位的天冬酰胺。2.一種具有促紅細胞生成素活性的天然人促紅細胞生成素類似物，該類似物包括I個額外N-糖基化位點，其中在天然人促紅細胞生成素氨基酸序列的第2位置換上了纈氨酸，第3位置換上了天冬酰胺，第4位置換上了苯丙氨酸，第5位置換上了絲氨酸；SP[Val2Asn3Phe4Ser5IEPO ;所述的額外N-糖基化位點是氨基酸序列第3位的天冬酰胺。3.—種...

【專利技術屬性】
技術研發人員：婁競，耿建玲，張杰，侯緒鳳，趙會林，陸軍，蘇冬梅，胡金東，
申請(專利權)人：沈陽三生制藥有限責任公司，
類型：發明
國別省市：