一種促紅細胞生成素模擬肽及其制備方法和應用技術

本發(fā)明專利技術提供了一種促紅細胞生成素模擬肽，所述模擬肽的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示：SEQ?ID?NO：1：GGLYACHMGPITX1HCQP?LRX2K；其中，X1為3-(1-萘基)-L-丙氨酸(Nal)，X2為肌氨酸(Sar)，所述氨基酸序列的氨基端經(jīng)乙酸酐修飾。該模擬肽可與鋅離子形成復合物。本發(fā)明專利技術還提供了該模擬肽的可藥用鹽。本發(fā)明專利技術還提供了該模擬肽及其可藥用鹽在制備用于治療紅細胞缺乏或紅細胞生成素缺乏或紅細胞群缺少或缺陷為特征的疾病的藥物中的應用。本發(fā)明專利技術的促紅細胞生成素模擬肽及其復合物能夠明顯紅細胞的生成，能夠顯著延長藥物在體內的半衰期。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術屬于生物醫(yī)學領域，涉及一種對促紅細胞生成素結構修飾獲得的促紅細胞生成素擬肽。
技術介紹
促紅細胞生成素是一種由腎臟合成并且分泌的活性糖蛋白，能夠結合紅細胞表面的促紅細胞生成素受體(EPOR)，刺激紅細胞的增生、分化和成熟，進而增加貧血患者體內的紅細胞數(shù)量，用以改善貧血狀況。分子量約34kD。血漿中存在的促紅細胞生成素由165個氨基酸組成，糖基化程度很高，糖的成分主要是唾液酸。根據(jù)碳水化合物含量不同,天然存在的促紅細胞生成素分為兩種類型即α型和β型，其中，α型含34％的碳水化合物，β型含26％的碳水化合物。兩種類型在生物學特性、抗原性及臨床應用效果上均相同。人類促紅細胞生成素基因位于7號染色體長22區(qū)。促紅細胞生成素(EPO)是腎臟產生的糖蛋白，主要作用于紅系祖細胞，促進其增殖與成熟,在紅細胞生成的過程中EPO主要與其它生長因子，如肝細胞生長因子(SCF)、胰島素生長因子(CIGF-1)共同協(xié)同作用于未成熟的紅系祖細胞。EPO主要作用于紅系祖細胞的增殖期與分化期，通過刺激其有絲分裂、激活紅系祖細胞特異基因，進而使紅系祖細胞大量增殖與分化，EPO還能特性型阻斷紅系祖細胞從紅細胞集落形成單位細胞(CFU-E)到早幼紅細胞階段的正常細胞凋亡，促使紅系祖細胞的生長與繁殖。EPO主要用于腎功能衰竭有關的貧血、腎小球間質細胞功能下降造成的骨髓造血干細胞功能減弱。EPO及其受體激動劑常用于伴有骨髓抑制的慢性腎炎或癌癥患者以及危重病人提高血紅蛋白水平和避免輸血。人EPOR的基因位于19號染色體上，裸肽分子質量為55KDa，糖基化后為66KDa，由508個氨基酸殘基組成(包括24個氨基酸殘基的先導序列)。人的EPO受體位于紅系祖細胞的細胞膜表面，由膜外區(qū)跨膜區(qū)與胞內區(qū)組成。胞質部分缺少酪氨酸激酶的特征排列順序，所以不具備酪氨酸激酶活性。在靠近跨膜區(qū)有BOX1和BOX2兩個同源盒，BOX1是EPOR與酪氨酸激酶相聯(lián)系的部位，跨膜區(qū)區(qū)域由24個疏水氨基酸構成，細胞外部分由4個保守型半胱氨酸基組成的結構區(qū)和WSXWS(Trp-Ser-X-Trp-Ser)構型，與某些細胞白細胞介素同屬一個受體家族，在轉導機制上有一定的共性。目前已知能表達EPO受體的細胞主要為：紅系干細胞、巨核細胞干細胞。另外已經(jīng)發(fā)現(xiàn)EPO還可作用于中樞神經(jīng)細胞上的EPOR。近年來，已在非紅系血細胞和非造血干細胞中發(fā)現(xiàn)了EPO的功能性受體，如髓系心肌細胞、平滑肌細胞等。由于EPO能特異性的作用于EPOR從而發(fā)揮一定的生理活性，可見EPO在一些功能性疾病的治療中有很大的作用。EPO作為促進紅細胞生成，增加紅細胞容量的主要激素，已廣泛應用于臨床，其中腎性貧血是其主要應用。典型的腎性貧血是正細胞正色素性貧血，通常在GFE＜20ml/min時發(fā)生。腎性貧血的原因包括：1、紅細胞壽命縮短，與氮質血癥、紅細胞本身對滲透壓氧化損傷機制刺激的抵抗力下降、以及脾功能亢進有關；2、血液丟失：包括透析失血、取血化驗、隱性胃腸道失血等；3、紅細胞生成受抑制：EPO相對缺乏是腎性貧血最主要的原因。EPO也可用于非腎性貧血的治療。其對腫瘤相關性貧血、人類免疫缺陷病毒(HIV)相關貧血、骨髓移植相關貧血等方面也有良好的療效。早在1989年，美國FDA就正式批準重組人促紅素(EPOGEN)用于腎性貧血的治療，但直到1992年重組人促紅素藥物才在我國上市。我國慢性腎炎的年發(fā)病率約為0.25％，其中相當一部分患者最終會轉為腎衰，每年的腎性貧血患者約50-60萬。根據(jù)保守的用藥量估算，如果按當前的價格30-40元/支，加上癌癥相關性貧血等患者的用藥，國內市場容量約12-16億元甚至更大(病人平均體重按50Kg計算)。自20世紀90年代后期，促紅細胞生成素已進入我國重點城市醫(yī)院暢銷藥品行列，2003年在全國重點城市樣本醫(yī)院用藥金額6213萬元，排名第56位。2004年，全國重點城市樣本醫(yī)院購藥金額增長到8049萬元，同比增長了30％。目前能夠作用促紅細胞生成素受體的肽已經(jīng)被確定。特別是確定了一組含有主要肽段的肽，這些肽可以和促紅細胞生成素受體結合并能剌激促紅細胞生成素細胞的分化增殖。中國專利ZL94109128.7公開了一種高糖基化的重組紅細胞生成刺激蛋白，臨床研究表明，體內半衰期相比于重組人EPO顯著延長，中國專利ZL00809895.6公開了一種促紅細胞生成素與聚乙二醇的偶聯(lián)物，平均每月注射1次即可相當于每周注射1-3次重組人EPO的效力。然而，這一類機制的藥物在體內均會與EPO抗體發(fā)生交叉反應，降低這一類藥物的療效。并且現(xiàn)有的重組人EPO藥物能夠刺激紅細胞增殖分化的肽的EC50都很低，僅在20nM和250nM之間，嚴重限制了重組人EPO的臨床應用。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術提供了一種分支的促紅細胞生成素模擬肽，本專利技術的多肽化合物與EPO受體結合，發(fā)揮受體激動作用，藉此治療與血紅細胞產生不足、缺陷或者過度消耗相關的疾病，本專利技術所使用的氨基酸除了包括本領域技術人員所熟知的二十種常見氨基酸外還包括部分非常見氨基酸，非常見氨基酸結構及名稱見表1表1非常見氨基酸的名稱和結構本專利技術提供了一種促紅細胞生成素模擬肽，所述模擬肽的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示：SEQIDNO：1：GGLYACHMGPITX1HCQPLRX2K；其中，X1為3-(1-萘基)-L-丙氨酸(Nal)，X2為肌氨酸(Sar)，所述氨基酸序列的氨基端經(jīng)乙酰化修飾。即本專利技術的模擬肽的氨基酸序列具體為：(Ac)GGLYACHMGPITNalHCQPLRSarK。所述乙酰化可以通過乙酸酐實現(xiàn)，乙酸酐的結構如下本專利技術還提供了一種促紅細胞生成素模擬肽的復合物，所述復合物包括所述的模擬肽和鋅離子。在根據(jù)本專利技術的一個實施方案中，所述復合物中每毫克所述模擬肽含有鋅離子0.0001mM～100mM；優(yōu)選地，每毫克所述模擬肽含有鋅離子0.001～0.1mM。另一方面本專利技術還提供了一種用于治療血紅細胞產生不足或缺陷相關的疾病的藥物組合物，所述藥物組合物包含一種或多種藥學上可接受的輔料以及所述模擬肽或復合物。在根據(jù)本專利技術的一個實施方案中，所述藥物組合物的輔料選自水溶性填充劑、pH調節(jié)劑、穩(wěn)定劑、注射用水和滲透壓調節(jié)劑中的一種或多種。在根據(jù)本專利技術的一個實施方案中，所述水溶性填充劑選自甘露醇、低分子右旋糖苷、山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖和半乳糖中的一種或多種。在根據(jù)本專利技術的一個實施方案中，所述pH調節(jié)劑選自枸櫞酸、磷酸、乳酸、酒石酸、鹽酸等非揮發(fā)性的酸，以及氫氧化鉀、氫氧化鈉或氫氧化銨、碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸銨鹽、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀和碳酸氫銨鹽中的一種或多種。在根據(jù)本專利技術的一個實施方案中，所述穩(wěn)定劑選自EDTA-2Na、硫代硫酸鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉、磷酸氫二鉀、碳酸氫鈉、碳酸鈉、精氨酸、谷氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、十二烷基硫酸鈉和三羥甲基氨基甲烷；優(yōu)選地選自以下的一種或多種：焦亞硫酸鈉、磷酸氫二鉀、精氨酸、聚乙二醇6000和三羥甲基氨基甲烷；所述滲透壓調節(jié)劑為氯化鈉和/或氯化鉀。再一方面，本專利技術還提供了所述的模擬肽復合物在制備用于治療與血紅細胞產生不足、血紅細胞缺陷或者血紅細胞過度消耗相關的本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】
一種促紅細胞生成素模擬肽，其特征在于，所述模擬肽的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示：SEQ?ID?NO：1GGLYACHMGPITX1HCQPLRX2K；其中，X1為3?(1?萘基)?L?丙氨酸(Nal)，X2為肌氨酸(Sar)，所述氨基酸序列的氨基端經(jīng)乙酰化修飾；優(yōu)選地，所述乙酰化通過乙酸酐實現(xiàn)。

【技術特征摘要】
1.一種促紅細胞生成素模擬肽，其特征在于，所述模擬肽的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示：SEQIDNO：1GGLYACHMGPITX1HCQPLRX2K；其中，X1為3-(1-萘基)-L-丙氨酸(Nal)，X2為肌氨酸(Sar)，所述氨基酸序列的氨基端經(jīng)乙酰化修飾；優(yōu)選地，所述乙酰化通過乙酸酐實現(xiàn)。2.一種促紅細胞生成素模擬肽的復合物，其特征在于，所述復合物包括如權利要求1所述的模擬肽和鋅離子。3.如權利要求2所述的復合物，其特征在于，所述復合物中每毫克所述模擬肽含有鋅離子0.0001mM～100mM；優(yōu)選地，每毫克所述模擬肽含有鋅離子0.001～0.1mM。4.一種用于治療血紅細胞產生不足或缺陷相關的疾病的藥物組合物，其特征在于，所述組合物包含一種或多種藥學上可接受的輔料以及如權利要求1所述模擬肽或權利要求2或3所述的復合物。5.如權利要求4所述的藥物組合物，其特征在于，所述輔料選自水溶性填充劑、pH調節(jié)劑、穩(wěn)定劑、注射用水和滲透壓調節(jié)劑中的一種或多種。6.如權利要求5所述的藥物組合物，其特征在于，所述水溶性填充劑選自甘露醇、低分子右旋糖苷、山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖和半乳糖中的一種或多種。7.如權利要求5或6所述的藥物組合物，其特征在于，所述pH調節(jié)劑選自枸櫞酸、...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：鄭學敏，魏群超，周植星，孔維苓，龔珉，徐為人，湯立達，
申請(專利權)人：天津藥物研究院有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：天津;12