本發明專利技術屬于生物醫藥領域,涉及復合干擾素半胱氨酸突變體、其聚乙二醇衍生物,后者的制備方法、藥物組合物和兩者在制備治療病毒性疾病的藥物中的用途。所述的復合干擾素半胱氨酸突變體是將復合干擾素氨基酸序列中從N端計的第75位的氨基酸突變為半胱氨酸;所述的復合干擾素半胱氨酸突變體的聚乙二醇衍生物是由所述的復合干擾素半胱氨酸突變體與聚乙二醇修飾劑連接得到,所述的聚乙二醇修飾劑的分子量在5KDa-40KDa之間。本發明專利技術的復合干擾素半胱氨酸突變體及其聚乙二醇衍生物有更高的生物學活性,更好的藥理作用與穩定性,并具有更可靠的安全性。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術一般的涉及干擾素α突變體、其聚乙二醇衍生物,后者的制備方法、藥物組合物和兩者在制備治療病毒性疾病的藥物中的用途,特別的涉及復合干擾素半胱氨酸突變體、其聚乙二醇衍生物,后者的制備方法、藥物組合物和兩者在制備治療病毒性疾病的藥物中的用途。
技術介紹
干擾素(interferon,IFN)是一種最初由動物機體產生的具有廣譜抗病毒作用的細胞因子類藥物,根據其產生部位與作用機理不同可以分為α、β、Y、λ等大的類型,而每種大的類型又可分為若干小的亞型,同一大的類型中不同的亞型間在一級結構上差異很小,在二級以上高級結構上非常接近。在幾種大的類型中,α型是應用最廣的一種,目前臨床應用的此型干擾素主要包括干擾素a 2a、干擾素a 2b、干擾素a lb、復合干擾素等。其中復合干擾素(consensus interferon或integrated interferon)是在對已知的α型干擾素進行序列比對后,把出現頻率最高的氨基酸分配到各自相應的位置,并對個別位置進行修改后得到的非天然氨基酸序列的人工設計α型干擾素,包括多種氨基酸序列的分子,但彼此間同源性高,它們的生物學活性為天然α型干擾素的10倍以上。雖然各種α型干擾素在當前治療病毒性感染疾病的過程中發揮著越來越廣泛的療效,但是其自身穩定性差、半衰期短的特點也限制了其進一步的臨床推廣應用,給病人用藥帶來了一些麻煩。鑒于此原 因,國內外開展了很多長效干擾素方面的基礎研究與產品開發,包括對干擾素分子自身進行改造、研發包括干擾素分子氨基酸序列的融合蛋白、對干擾素分子進行化學修飾、選擇適宜的藥物輸送體系優化干擾素分子的體內輸送與藥效發揮過程等,其中聚乙二醇修飾干擾素(屬于化學修飾的干擾素)的上市是在這一領域取得的最大成功。聚乙二醇(polyethelene glycol, PEG)是一種線性高分子化合物,由于其良好的生物相容性和既親水又親酯的雙親特性,得以從眾多的化學修飾劑中脫穎而出成為目前研究與應用最廣的蛋白多肽類藥物的修飾劑。經過多年的研究開發,目前已有兩個PEG修飾的干擾素α產品成功上市,分別是美國先靈葆雅(Schering-Plough)公司(現已被默沙東公司收購)的PEG修飾的干擾素a2b (商品名為“佩樂能”)和瑞士羅氏(Roche)公司的PEG修飾的干擾素a2a (商品名為“派羅欣”),分別于2001年和2002年在美國上市,在2003年同時進入中國內地銷售。關于先靈葆雅公司的PEG修飾的干擾素a2b,在中國專利申請CN00808452.1中對其配方組成有所描述;而羅氏公司的PEG修飾的干擾素a 2a則在中國專利CN97113049.3中有詳細描述。除此之外,還有更多的PEG修飾的干擾素α產品正在研究開發中,其中最接近上市階段的是Intermune公司開發的PEG修飾的復合干擾素。縱觀PEG修飾干擾素α技術的發展,主要是伴隨著PEG修飾技術的發展。早期的研究和開發主要圍繞非特異性位點PEG修飾技術,所選用的PEG修飾劑純度低、分子量小(一般在IOKDa以下)且分布范圍寬、修飾位點種類和數量多且形成的修飾衍生物不穩定,造成修飾產物組成不均一、純度相對較低(85%左右)、質量控制不易實現、長效作用不明顯且仍有一定的毒副作用。上述先靈葆雅公司的PEG修飾的干擾素a 2b產品就屬于此類型。伴隨著PEG修飾劑的發展出現了特異性位點PEG修飾技術,由于所選用的PEG修飾劑的純度得到了很大提高,分子量可達20KDa以上且分布范圍大幅縮窄,且修飾機理的改善使修飾位點種類和數量減少,形成的修飾衍生物穩定性提高,從而使上述非特異性位點PEG修飾技術的缺點得到了很大程度的改善。特異性位點PEG修飾技術又可分為三種類型,一種是用具有分支結構的PEG修飾劑修飾目標蛋白分子,借助分支結構PEG修飾劑較強的空間位阻效應達到減少修飾位點數量的目的。上述羅氏公司的PEG修飾的干擾素a2a產品就屬于此類型。但是由于這種所謂的“特異性位點”修飾技術從修飾機理上既不能做到只修飾單一種類的氨基酸,也不能做到只修飾單一位點的氨基酸,所以修飾位點的種類與數目依然眾多,如中國專利CN200380103341.1公開了分支結構PEG修飾的干擾素a 2a (包括羅氏公司的PEG修飾干擾素a 2a產品“派羅欣”)具有12個修飾位點的異構體。第二種是修飾蛋白質分子N末端氨基酸的自由α-氨基,原理是蛋白質N末端氨基酸的自由α-氨基與蛋白質其它位點中賴氨酸的自由ε-氨基相比具有更低的pKa值,可以在更低的PH下與氨基修飾劑發生修飾反應。但是由于這種pH選擇反應的特異性并不是太高,即使在較低的PH下仍可發生賴氨酸的自由ε -氨基上的修飾反應,且修飾過程可能遮蔽蛋白質分子的活性位點,造成修飾產物活性大大降低,因此這種修飾技術在實際應用中也受到限制。第三種是用巰基修飾劑修飾蛋白質分子半胱氨酸上的巰基,由于蛋白質分子中的半胱氨酸數量很少,且多數半胱氨酸上的巰基用于形成分子內或分子間二硫鍵,只有極少的游離巰基可供修飾 ,所以這種修飾反應的特異性很高。如中國專利申請CN200510076676.X公開了一種巰基PEG修飾劑修飾的干擾素a lb,利用了干擾素a Ib分子中只有一個自由巰基的特點用巰基PEG修飾劑對其進行修飾。但是此種技術實際拓展應用的最大問題是天然蛋白質分子中基本上沒有游離的半胱氨酸殘基,即使有也會因非常明顯的影響蛋白質分子的穩定性和純化過程(容易形成分子內或分子間二硫鍵)而使用于修飾的蛋白質純品不易得到,使修飾過程無法實現(因為一旦形成分子內或分子間二硫鍵就沒有可供修飾的游離半胱氨酸);且選擇天然位點的半胱氨酸進行修飾同樣可能遮蔽蛋白質分子的活性位點,造成修飾產物活性大大降低。上述PEG修飾的干擾素a Ib就因干擾素a Ib自身較低的生物活性和修飾后活性殘留率也較低,從而使最終的PEG修飾產物活性更低,實際應用效果有待論證。另外干擾素α種類亞型眾多,序列中有許多位點可供改變以產生活性更高的突變干擾素α產物,如美國專利US4695623、US4897471、US5372808就公開了一種活性為天然序列干擾素α 10倍以上的復合干擾素分子。所以也可利用干擾素α的這一特點選擇活性高、穩定性好與毒性低的突變干擾素α進行PEG修飾,以提高或改善修飾產物的藥效、藥代與安全性,前述Intermune公司的PEG修飾的復合干擾素就屬于此類型,又如中國專利申請CN02159951.3也公開了一種分支結構PEG修飾劑修飾的復合干擾素。但是單一利用此種技術依然不能解決修飾產物組成不均一、純度差、質量控制不易實現、長效作用不明顯且仍有一定毒副作用的問題。
技術實現思路
本專利技術的首要目的是提供一種復合干擾素的半胱氨酸突變體,以解決現有的干擾素α中沒有游離的半胱氨酸殘基可供特異性位點巰基PEG修飾劑修飾或所具有或突變的游離半胱氨酸殘基位點不理想,造成蛋白質分子不穩定、活性低、分離純化困難而不利于特異性位點PEG修飾劑修飾的問題。為實現此目的,在基礎的實施方案中,本專利技術的復合干擾素的半胱氨酸突變體將復合干擾素氨基酸序列中從N端計的第75-77位之一的氨基酸突變為半胱氨酸,分別具有SEQ ID N0.1-3所示的氨基酸序列。本專利技術選擇本文檔來自技高網...
【技術保護點】
復合干擾素突變體,其特征是將復合干擾素氨基酸序列中從N端計的第75位的氨基酸突變為半胱氨酸,具有SEQ?ID?No.1所示的氨基酸序列。
【技術特征摘要】
1.復合干擾素突變體,其特征是將復合干擾素氨基酸序列中從N端計的第75位的氨基酸突變為半胱氨酸,具有SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列。2.根據權利要求1所述的復合干擾素突變體的聚乙二醇衍生物,其特征是所述的聚乙二醇衍生物由所述的復合干擾素突變體與聚乙二醇修飾劑連接得到,所述的聚乙二醇修飾劑的分子量在5KDa-40KDa之間。3.根據權利要求2所述的聚乙二醇衍生物,其特征是所述的聚乙二醇修飾劑是巰基聚乙二醇修飾劑,選自馬來酰亞胺PEG修飾劑、乙烯砜基PEG修飾劑、碘乙酰胺PEG修飾劑或鄰吡啶基二硫化物PEG修飾劑中的一種。4.根據權利要求2所述的聚乙二醇衍生物,其特征是所述的聚乙二醇修飾劑的分子量在 10KDa-20KDa 之間。5.根據權利要求2-4之一所述的聚乙二醇衍生物的制備方法...
【專利技術屬性】
技術研發人員:周敏毅,劉金毅,程永慶,
申請(專利權)人:北京三元基因工程有限公司,
類型:發明
國別省市:
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