一種促紅細(xì)胞生成素類似物制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種具有至少一個(gè)額外糖基化位點(diǎn)的促紅細(xì)胞生成素類似物或其變體。本發(fā)明專利技術(shù)還涉及編碼該促紅細(xì)胞生成素類似物或其變體的DNA序列，以及供該類似物或其變體表達(dá)的重組質(zhì)粒和宿主細(xì)胞。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于基因工程
，具體地說(shuō)涉及一種具有至少一個(gè)額外糖基化位點(diǎn)的促紅細(xì)胞生成素類似物或其變體。本專利技術(shù)還涉及編碼所述促紅細(xì)胞生成素類似物或其變體的DNA序列，以及表達(dá)該類似物或其變體的重組質(zhì)粒和宿主細(xì)胞。
技術(shù)介紹
促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin, ΕΡ0)是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于臨床的造血生長(zhǎng)因子。早在1906年，Carnot等發(fā)現(xiàn)兔失血后會(huì)在外周血中產(chǎn)生一種可作用于造血系統(tǒng)以加速紅細(xì)胞生成的物質(zhì)，由此提出存在一種體液因子以反饋方式調(diào)節(jié)血細(xì)胞生成。時(shí)隔30多年以后此觀點(diǎn)才得以證實(shí)，這種因子被命名為促紅細(xì)胞生成素。促紅細(xì)胞生成素又稱血細(xì)胞生成素、紅細(xì)胞刺激因子，屬·酸性糖蛋白，是調(diào)節(jié)前體紅細(xì)胞增殖、分化以及保持外周血中紅細(xì)胞濃度處于正常生理范圍內(nèi)的最主要激素。它可與紅細(xì)胞前體細(xì)胞表面的EPO受體結(jié)合，促進(jìn)其血紅蛋白的合成使之增殖分化成紅細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)體內(nèi)紅細(xì)胞和血紅蛋白的生理平衡。EPO是一個(gè)強(qiáng)有力的造血生長(zhǎng)因子，體外分析顯示在0.05 lU/ml的濃度時(shí)即具有劑量依賴效應(yīng)。EPO可刺激紅系祖細(xì)胞(BFU-E)和早幼稚紅細(xì)胞(CFU-E)形成成熟的紅細(xì)胞集落。EPO除了作用于骨髓巨核前體細(xì)胞外，對(duì)其他造血細(xì)胞均無(wú)作用，是迄今認(rèn)為作用最單一的造血生長(zhǎng)因子。當(dāng)然，對(duì)紅細(xì)胞造血過(guò)程的完整調(diào)節(jié)，除了 EPO外，還需要其他因子的協(xié)同作用，包括Mult1-CSF、GM-CSF和IL-1，這些因子促使干細(xì)胞變成BFU-E，并聯(lián)合刺激使紅細(xì)胞早期增殖，隨后才是EPO的增殖作用。1977年，Miyake等從重癥再障貧血病人的尿中提取得到了 EPO的純品，由于起始來(lái)源的匱乏，很難得到大量純品以充分研究其生物學(xué)和分子學(xué)性質(zhì)。1984年，科學(xué)家們首次以人腎癌細(xì)胞的EPO mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA并在大腸桿菌中得以克隆并表達(dá)，在此基礎(chǔ)上獲得了 EPO的完整基因并在真核細(xì)胞中進(jìn)行高效表達(dá)，為深入研究EPO的生物學(xué)效應(yīng)并將之應(yīng)用于臨床奠定了基礎(chǔ)?，F(xiàn)在國(guó)內(nèi)外已能用基因工程方法生產(chǎn)重組人紅細(xì)胞生成素(rhEPO)，并用于臨床治療多種紅細(xì)胞減少癥，具有很好的療效。真核細(xì)胞產(chǎn)生的許多細(xì)胞表面蛋白和分泌蛋白，都被一個(gè)或更多寡糖基團(tuán)修飾。這種稱為糖基化的修飾能強(qiáng)烈影響蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、分泌和亞細(xì)胞定位也會(huì)起重要作用。正確的糖基化有時(shí)是生物活性所必需的。某些真核生物的基因在缺乏使蛋白糖基化的細(xì)胞過(guò)程的細(xì)菌(如大腸桿菌)中表達(dá)，所回收到的蛋白由于缺乏糖基化而沒(méi)有或幾乎沒(méi)有活性。糖基化作用出現(xiàn)在多肽骨架的特異位置，通常有兩類:0連接糖基化和N連接糖基化。O連接的寡糖連在絲氨酸或蘇氨酸殘基上，而N連接的寡糖則連接在作為序列Asn-X-Ser/Thr 一部分的天冬酰胺殘基上，其中X可以是除脯氨酸以外的任何氨基酸。N連接和O連接的寡糖結(jié)構(gòu)及每種類型中存在的糖殘基都是不同的。共同存在于兩種類型中的一類糖是N-乙?；窠?jīng)氨酸(以下簡(jiǎn)稱唾液酸)。唾液酸通常是N連接和O連接寡糖的末端殘基，由于它帶負(fù)電荷，可能會(huì)使糖蛋白具有酸性。成熟的EPO由166個(gè)氨基酸組成，氨基酸序列參見(jiàn)SEQ ID NO: 1，肽鏈結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。EPO分子內(nèi)有兩個(gè)二硫鍵，3個(gè)N-鍵糖基化位點(diǎn)和I個(gè)O-鍵糖基化位點(diǎn)，其中兩個(gè)二硫鍵在變性EPO復(fù)性并折疊成有生物活性構(gòu)型時(shí)是必不可少的。天然人促紅細(xì)胞生成素和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的人促紅細(xì)胞生成素都含有三個(gè)N連接寡糖鏈和一個(gè)O連接寡糖鏈，它們共占蛋白總分子量的40%。N連接糖基化出現(xiàn)在24、38、83位的天冬酰胺殘基，而O連接糖基化則出現(xiàn)在 126 位的絲氨酸殘基(Lai 等,J.Biol.Chem.261:3116,1986 ；Broundy 等，Arch.Biochem.Biophys.265:329,1988))。已證明寡糖鏈被末端唾液酸殘基修飾。對(duì)糖基化促紅細(xì)胞生成素進(jìn)行酶處理而脫除唾液酸殘基后，導(dǎo)致體內(nèi)活性喪失，但不影響體外活性(Lowy等，Naturel85:102,1960 ；Goldwasser 等，J.Biol.Chem.249:4202,1974)。這一現(xiàn)象曾被解釋為無(wú)唾液酸促紅細(xì)胞生成素由于與肝無(wú)唾液酸糖蛋白結(jié)合蛋白相互作用而從循環(huán)中迅速清除(Morrell 等，J.Bi0.Chem.243:155,1968 出riggs等Am.J.Physiol.227:1385，1974 ；AshwelI,Methods Enzymo1.50:287,1978)。因此促紅細(xì)胞生成素只有在被唾液酸酸化從而避免被肝結(jié)合時(shí)才具有體內(nèi)生物活性。在促紅細(xì)胞生成素的寡糖中，其作用還不十分確定。已證明，部分脫糖基化的促紅細(xì)胞生成素與糖基化形式相比，體內(nèi)活性大大降低，但保留了體外活性(Dordal等，Endocrinologyl 16:2293,1985)。但另一項(xiàng)研究則表明，如果使作為糖基化位點(diǎn)的天冬酰胺或絲氨酸殘基發(fā)生突變，從而單獨(dú)或共同脫除N連接或O連接的寡糖鏈，則會(huì)使在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生的突變蛋白的體外活性急劇下降(Dube等，J.Biol.Chem.263:17516，1988)。糖蛋白如促紅細(xì)胞生成素，可以用諸如等電聚焦(IEF)等技術(shù)分離成不同帶電形式。粗制及部分純化的促紅細(xì)胞生成素制備物的IEF研究已有多方報(bào)道(Lukosky等，J.Biochem.50:909,1972 ；Shelton 等，Biochem.Med.12:45,1975 ；Fuhr 等，Biochem.Biophys.Res.Comm.98:930,1981)。在Miyake等人所討論的從人尿純化人促紅細(xì)胞生成素中，通過(guò)羥基磷灰石色譜法得到的兩個(gè)促紅細(xì)胞生成素組分。這兩個(gè)組分被定名為I1、IIIA。隨后對(duì)II和III A進(jìn)行的碳水化合物分析表明，組分II的唾液酸含量比組分III A高。進(jìn)一步研究還表明，一個(gè)位點(diǎn)的糖基化程度很大程度上取決于其周圍氨基酸的組成(Kasturi 等，Biochem.J.323:415，1997 ；Elliott 等，JBC.279:16854，2004)，因此，改變N-糖基化位點(diǎn)附近氨基酸組成會(huì)在很大程度上影響糖基化的程度。增加促紅細(xì)胞生成素碳水化合物的數(shù)目，并因此而增加每個(gè)促紅細(xì)胞生成素分子的唾液酸數(shù)目，可以產(chǎn)生一些優(yōu)越的性質(zhì)，例如溶解度提高、更耐受蛋白水解作用、免疫原性下降、血清半衰期延長(zhǎng)、生物活性提高。本專利技術(shù)通過(guò)突變天然EPO序列中的若干個(gè)氨基酸殘基增加N-糖基化位點(diǎn)數(shù)而提高了 EPO類似物的性能。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)涉及一種具有促紅細(xì)胞生成素活性的天然人促紅細(xì)胞生成素類似物或其變體，該類似物包括至少一個(gè)額外N-糖基化位點(diǎn)， 其位點(diǎn)范圍位于人促紅細(xì)胞生成素氨基酸序列的1-9，28-32，40-55，86-92，112-133，162-166位，以及該變體在該類似物的氨基酸序列中具有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的缺失、替換或添加，且具有該類似物等同的活性。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，額外N-糖基化位點(diǎn)位于人促紅細(xì)胞生成素氨基酸序列的1-6，28-32，87-90位。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，額外N-糖基化位點(diǎn)的數(shù)為1-3個(gè)。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本專利技術(shù)的類似物在天然人促紅細(xì)胞生成素氨基酸序列的2、3本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種具有促紅細(xì)胞生成素活性的天然人促紅細(xì)胞生成素類似物，該類似物包括2個(gè)額外N?糖基化位點(diǎn)，其中在天然人促紅細(xì)胞生成素氨基酸序列的第28、88位分別置換上了天冬酰胺，第30、90位分別置換上了絲氨酸；即[Asn28Ser30Asn88Ser90]EPO；所述的2個(gè)額外N?糖基化位點(diǎn)分別是氨基酸序列第28、88位的天冬酰胺。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種具有促紅細(xì)胞生成素活性的天然人促紅細(xì)胞生成素類似物，該類似物包括2個(gè)額外N-糖基化位點(diǎn)，其中在天然人促紅細(xì)胞生成素氨基酸序列的第28、88位分別置換上了天冬酰胺，第30、90位分別置換上了絲氨酸；即[Asn28Ser30Asn88Ser90]EPO ;所述的2個(gè)額外N-糖基化位點(diǎn)分別是氨基酸序列第28、88位的天冬酰胺。2.—種DNA序列，該DNA序列編碼權(quán)利要求1的人促紅細(xì)胞生成素類似物。3.—種表達(dá)載體，該表達(dá)載體含有權(quán)利要求2的DNA序列。4.一種真核宿主...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：婁競(jìng)，耿建玲，張杰，侯緒鳳，趙會(huì)林，陸軍，蘇冬梅，胡金東，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：沈陽(yáng)三生制藥有限責(zé)任公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：