重組促紅細胞生成素及制備方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及化學修飾的重組促紅細胞生成素及制備方法，采用基因工程技術(shù)對促紅素進行重組，在促紅素中引入了具有化學活潑酮基的4-乙酰苯丙氨酰殘基，在聚乙二醇對重組促紅素共價修飾時，聚乙二醇特異性地與4-乙酰苯丙氨酰殘基反應(yīng)，反應(yīng)完全，且不與其他氨基酸殘基發(fā)生反應(yīng)，所需要的反應(yīng)條件較溫和，解決了現(xiàn)有技術(shù)中選擇性差、反應(yīng)條件惡劣的問題。聚乙二醇化的重組促紅素的藥代動力學研究結(jié)果、血細胞比容測定結(jié)果均優(yōu)于天然的促紅素。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及，具體涉及化學修飾的。
技術(shù)介紹
促紅細胞生成素(Erythropoietin)也稱促紅素,英文簡稱ΕΡ0,是一種糖蛋白激素，其主要的生理功能是刺激骨髓紅細胞前體細胞的分化與增殖，因此EPO被認為是促進紅細胞的產(chǎn)生并能夠調(diào)節(jié)體內(nèi)的紅細胞總量在最適宜水平的主要調(diào)節(jié)因子。天然人促紅細胞生成素(hEPO)是一種主要由腎臟合成并分泌的糖蛋白激素。當腎臟功能衰竭時，EPO就無法正常合成，因而導致紅細胞生成數(shù)量的減少，即造成貧血。貧血是慢性腎病的常見癥狀之一，以前對于慢性腎病引起的貧血沒有有效的預防和治療措施，基本上只能是通過輸血來暫時緩解癥狀。 隨著現(xiàn)代基因技術(shù)的發(fā)展，1984年重組人促紅素(r-HuEPO)首次研究成功并廣泛應(yīng)用于臨床，大大加速了人們對促紅素的基礎(chǔ)及應(yīng)用研究，并為腎性貧血病患者提供了新的醫(yī)療途徑。現(xiàn)有的研究表明促紅素的作用要比以前所認識到的廣泛，它不僅適用于慢性腎功能衰竭導致的貧血、惡性腫瘤或化療導致的貧血、失血后貧血和艾滋病引起的貧血等，還可以降低病人對輸血的需求，減少艾滋病以及病毒性肝炎等通過血液制品傳播疾病的發(fā)生幾率。目前，越來越多得貧血患者在接受EPO治療。目前醫(yī)藥市場上的促紅素產(chǎn)品以第一代重組促紅素為主，主要在中華豚鼠細胞內(nèi)表達和然后純化。而第一代重組促紅素，因其血漿半衰期較短以及對蛋白酶降解的敏感性，其在體內(nèi)的生物利用度較低。針對第一代產(chǎn)品的缺陷，目前已經(jīng)開發(fā)出第二代重組促紅素產(chǎn)品(以羅氏制藥(Roche)開發(fā)出來的CERA為代表)，即經(jīng)聚乙二醇(PEG)修飾的重組促紅素。聚乙二醇(PEG)的非抗原性水溶性聚合物常被運用到治療和診斷有重大意義的多肽的共價修飾上。例如PEG共價連接到白介素、干擾素等治療性多肽上，已經(jīng)報道PEG的共價修飾可以延長這些治療性多肽在體內(nèi)的半衰期、和/或降低它們的免疫原性和抗原性。同樣的，PEG的共價修飾也適用于重組促紅素。臨床實驗也證明了，將無體內(nèi)活性或生物利用度較低的重組促紅素經(jīng)聚乙二醇共價修飾，可以獲得具有體內(nèi)促紅細胞生產(chǎn)活性的重組促紅素產(chǎn)品，該產(chǎn)品的半衰期是第一代重組促紅素產(chǎn)品的16倍以上。除了 PEG以外，其他的聚環(huán)氧烷(非抗原性水溶性聚合物)也能用于修飾重組促紅素，起到延長血漿半衰期的作用。到目前為止，已經(jīng)公開了重組促紅素的多種類型的聚乙二醇化學修飾方法，例如W094/28024公開了一種具有促紅細胞生成素活性的糖修飾的PEG綴合物，其中PEG與rEPO的被氧化的糖鏈連接，在PEG化學修飾方法中，A)若只是采用純化學的方法綴合到PEG上(例如羅氏制藥的CERA是通過對重組促紅素內(nèi)的自由氨基進行PEG化學修飾)，這類方法通常都存在選擇性差(無法定向和/或特異性修飾)，以及反應(yīng)條件惡劣等缺陷；B)采用PEG對重組促紅素的被氧化的糖基進行共價修飾，由于共價修飾前涉及到糖基化以及糖基氧化的步驟，這類方法同樣存在選擇性差、反應(yīng)不完全的缺陷。WO 90/12874中公開了單甲氧基-PEG-EPO(mPEG-EPO)的制備方法，其中EPO內(nèi)通過基因工程手段導入了一個半胱氨酸殘基，再將特定的PEG試劑共價連接到該殘基上。將非天然氨基酸用基因編入法引入蛋白質(zhì)是實現(xiàn)在單氨基酸殘基水平上選擇性標記蛋白質(zhì)的一種非常有效的方法，該方法利用一琥珀型抑制因子tRNA(tRNAraA)通讀一個存在于mRNA讀碼框內(nèi)的琥珀型終止密碼子(UAG)，在此過程中，氨酰基_tRNA合成酶對該tRNA進行了非天然氨基酸酰化，該體系與發(fā)現(xiàn)于一些產(chǎn)(甲)烷古生菌和一種革蘭氏陽性菌(Desulfitobacterium hafniense)細胞內(nèi)天然進行的卩比咯賴氨酸(Pyl)引入機制相同，在這些生物細胞內(nèi)，一個讀碼框內(nèi)的琥珀密碼子對Pyl進行共同翻譯并插入蛋白質(zhì)中，這一琥珀密碼子被一類具有CUA反密碼子并且由吡咯賴氨酰基氨酰基-tRNA合成酶(PylRS)進行Pyl酰化的Pyl琥珀型抑制因子tRNA(pylT)所抑制，這些生物體內(nèi)的PylRS-pylT配對體與細胞內(nèi)其他類型的合成酶-tRNA配對體正交，即無相互作用，因此該配對體只針對Pyl以確保精確引入Pyl。與Pyl引入機制類似，特定的氨酰基-tRNA合成酶可以將非天然氨基酸特定連接到其同源tRNAo^上,形成正交的合成酶-tRNA·配對體，當這一合成酶-tRNAo^配對體在細胞中表達時，非天然氨基酸在琥珀密碼子處被高效、精確地定點引入到蛋白質(zhì)中。這一方法可在細菌、酵母、及哺乳動物細胞內(nèi)將多種非天然氨基酸定點引入蛋白質(zhì)，并用以研究大量生物學課題。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)引入了兩種非天然氨基酸，4-乙酰苯丙氨酸(AcF)和2-氨基-8-羰基壬酸(KetoK)，均包含功能性酮基，引入這兩類非天然氨基酸可用于蛋白質(zhì)定點修飾。本專利技術(shù)將這兩類非天然氨基酸引入促紅細胞生成素(EPO)基因，并成功用于促紅細胞生成素與帶有羥胺基的20K聚乙二醇(PEG)的共價連接。 本專利技術(shù)提供了兩種化學修飾的重組促紅細胞生成素，在第一種重組促紅細胞生成素中，第65位和/或第152位的氨基酸殘基為4-乙酰苯丙氨酰殘基，至少一個4-乙酰苯丙氨酰殘基上共價連接了聚乙二醇；在第二種重組促紅細胞生成素中，第65位和/或第152位的氨基酸殘基為2-氨-8-氧代壬酰殘基，至少一個2-氨-8-氧代壬酰殘基上共價連接了聚乙二醇。本專利技術(shù)還提供了上述化學修飾的重組促紅細胞生成素的制備方法，該方法采用基因工程技術(shù)時促紅素進行重組，在促紅細胞生成素的第65位和/或第152位上引入具有化學活潑酮基的氨基酸殘基，該氨基酸殘基為4-乙酰苯丙氨酰殘基或2-氨-8-氧代壬酰殘基，然后用聚乙二醇對氨基酸殘基進行化學修飾，聚乙二醇特異性地與4-乙酰苯丙氨酰殘基或2-氨-8-氧代壬酰殘基反應(yīng)，反應(yīng)完全且不與其他氨基酸殘基發(fā)生反應(yīng)，所需要的反應(yīng)條件較溫和，解決了現(xiàn)有技術(shù)中選擇性差、反應(yīng)條件惡劣的問題。用來化學修飾4-乙酰苯丙氨酰殘基或2-氨-8-氧代壬酰殘基的聚乙二醇是一類親水聚合物，優(yōu)選地，羥氨基或聯(lián)氨基取代的聚乙二醇，這類聚乙二醇可以更特異地與4-乙酰苯丙氨酰殘基或2-氨-8-氧代壬酰殘基上的化學活潑的酮基反應(yīng)，反應(yīng)更完全，所需的反應(yīng)條件很溫和，一般只需要在生理條件下反應(yīng)即可。具有4-乙酰苯丙氨酰殘基的重組促紅細胞生成素的制備方法包括(I)構(gòu)建含有編碼4-乙酰苯丙氨酰-tRNA合成酶基因、琥珀突變抑制tRNA基因、在第65位和/或第152位發(fā)生琥珀無義突變的促紅細胞生成素基因的重組表達載體，編碼4-乙酰苯丙氨酰-tRNA合成酶基因序列如SEQ ID No. 2所述，琥珀突變抑制tRNA基因序列如SEQ ID No.1所述，在第65位發(fā)生琥珀無義突變的促紅細胞生成素基因序列如SEQID No. 3所述，在第152位發(fā)生琥珀無義突變的促紅細胞生成素基因序列如SEQ ID No. 4所述；(2)將所述重組表達載體轉(zhuǎn)染宿主細胞，培養(yǎng)所述宿主細胞并從中分離得到在第65位和/或第152位具有4-乙酰苯丙氨酰殘基的重組促紅細胞生成素；(3)采用聚乙二醇對分離得到的所述重組促紅細胞生成素上的至少一個4-乙酰苯丙氨酰殘基進行化學修飾。在一種具體實施方式中,所述重組表達載體為重組質(zhì)粒pcDNA3.1-EctRN本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種化學修飾的重組促紅細胞生成素，其中，第152位的氨基酸殘基為4?乙酰苯丙氨酰殘基，所述的4?乙酰苯丙氨酰殘基是通過在促紅細胞生成素基因序列的第152位發(fā)生琥珀無義突變后由該琥珀無義突變的位置翻譯而成的，在第152位發(fā)生琥珀無義突變的促紅細胞生成素基因序列如SEQ?ID?No.4所述，所述的4?乙酰苯丙氨酰殘基上共價連接了聚乙二醇。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種化學修飾的重組促紅細胞生成素，其中，第152位的氨基酸殘基為4-乙酰苯丙氨酰殘基，所述的4-乙酰苯丙氨酰殘基是通過在促紅細胞生成素基因序列的第152位發(fā)生琥珀無義突變后由該琥珀無義突變的位置翻譯而成的，在第152位發(fā)生琥珀無義突變的促紅細胞生成素基因序列如SEQ ID No. 4所述，所述的4-乙酰苯丙氨酰殘基上共價連接了聚乙二醇。2.如權(quán)利要求1所述的重組促紅細胞生成素，其中，所述的聚乙二醇為羥氨基或聯(lián)氨基取代的聚乙二醇。3.制備如權(quán)利要求1所述的重組促紅細胞生成素的方法，其中，該方法包括 (1)構(gòu)建含有編碼4-乙酰苯丙氨酰-tRNA合成酶基因、琥珀突變抑制tRNA基因、在第152位發(fā)生琥珀無義突變的促紅細胞生成素基因的重組表達載體，所述編碼4-乙酰苯丙氨酰-tRNA合成酶基因序列如SEQ ID No. 2所述，所述琥珀突變抑制tRNA基因序列如SEQ IDNo.1所述，所述在第152位發(fā)生琥珀無義突變的...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：萬為，
申請(專利權(quán))人：蘇州元基生物技術(shù)有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：