重組促紅細(xì)胞生成素及制備方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及化學(xué)修飾的重組促紅細(xì)胞生成素及制備方法，采用基因工程技術(shù)對促紅素進(jìn)行重組，在促紅素中引入了具有化學(xué)活潑酮基的2-氨-8-氧代壬酰殘基，在聚乙二醇對重組促紅素共價(jià)修飾時(shí)，聚乙二醇特異性地與2-氨-8-氧代壬酰殘基反應(yīng)，反應(yīng)完全，且不與其他氨基酸殘基發(fā)生反應(yīng)，所需要的反應(yīng)條件較溫和，解決了現(xiàn)有技術(shù)中選擇性差、反應(yīng)條件惡劣的問題。聚乙二醇化的重組促紅素的藥代動力學(xué)研究結(jié)果、血細(xì)胞比容測定結(jié)果均優(yōu)于天然的促紅素。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及，具體涉及化學(xué)修飾的。
技術(shù)介紹
促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin)也稱促紅素,英文簡稱ΕΡ0,是一種糖蛋白激素，其主要的生理功能是刺激骨髓紅細(xì)胞前體細(xì)胞的分化與增殖，因此EPO被認(rèn)為是促進(jìn)紅細(xì)胞的產(chǎn)生并能夠調(diào)節(jié)體內(nèi)的紅細(xì)胞總量在最適宜水平的主要調(diào)節(jié)因子。天然人促紅細(xì)胞生成素(hEPO)是一種主要由腎臟合成并分泌的糖蛋白激素。當(dāng)腎臟功能衰竭時(shí)，EPO就無法正常合成，因而導(dǎo)致紅細(xì)胞生成數(shù)量的減少，即造成貧血。貧血 是慢性腎病的常見癥狀之一，以前對于慢性腎病引起的貧血沒有有效的預(yù)防和治療措施，基本上只能是通過輸血來暫時(shí)緩解癥狀。隨著現(xiàn)代基因技術(shù)的發(fā)展，1984年重組人促紅素(r-HuEPO)首次研究成功并廣泛應(yīng)用于臨床，大大加速了人們對促紅素的基礎(chǔ)及應(yīng)用研究，并為腎性貧血病患者提供了新的醫(yī)療途徑。現(xiàn)有的研究表明促紅素的作用要比以前所認(rèn)識到的廣泛，它不僅適用于慢性腎功能衰竭導(dǎo)致的貧血、惡性腫瘤或化療導(dǎo)致的貧血、失血后貧血和艾滋病引起的貧血等，還可以降低病人對輸血的需求，減少艾滋病以及病毒性肝炎等通過血液制品傳播疾病的發(fā)生幾率。目前，越來越多得貧血患者在接受EPO治療。目前醫(yī)藥市場上的促紅素產(chǎn)品以第一代重組促紅素為主，主要在中華豚鼠細(xì)胞內(nèi)表達(dá)和然后純化。而第一代重組促紅素，因其血漿半衰期較短以及對蛋白酶降解的敏感性，其在體內(nèi)的生物利用度較低。針對第一代產(chǎn)品的缺陷，目前已經(jīng)開發(fā)出第二代重組促紅素產(chǎn)品(以羅氏制藥(Roche)開發(fā)出來的CERA為代表)，即經(jīng)聚乙二醇(PEG)修飾的重組促紅素。聚乙二醇(PEG)的非抗原性水溶性聚合物常被運(yùn)用到治療和診斷有重大意義的多肽的共價(jià)修飾上。例如PEG共價(jià)連接到白介素、干擾素等治療性多肽上，已經(jīng)報(bào)道PEG的共價(jià)修飾可以延長這些治療性多肽在體內(nèi)的半衰期、和/或降低它們的免疫原性和抗原性。同樣的，PEG的共價(jià)修飾也適用于重組促紅素。臨床實(shí)驗(yàn)也證明了，將無體內(nèi)活性或生物利用度較低的重組促紅素經(jīng)聚乙二醇共價(jià)修飾，可以獲得具有體內(nèi)促紅細(xì)胞生產(chǎn)活性的重組促紅素產(chǎn)品，該產(chǎn)品的半衰期是第一代重組促紅素產(chǎn)品的16倍以上。除了 PEG以外，其他的聚環(huán)氧烷(非抗原性水溶性聚合物)也能用于修飾重組促紅素，起到延長血漿半衰期的作用。到目前為止，已經(jīng)公開了重組促紅素的多種類型的聚乙二醇化學(xué)修飾方法，例如W094/28024公開了一種具有促紅細(xì)胞生成素活性的糖修飾的PEG綴合物，其中PEG與rEPO的被氧化的糖鏈連接，在PEG化學(xué)修飾方法中，A)若只是采用純化學(xué)的方法綴合到PEG上(例如羅氏制藥的CERA是通過對重組促紅素內(nèi)的自由氨基進(jìn)行PEG化學(xué)修飾)，這類方法通常都存在選擇性差(無法定向和/或特異性修飾)，以及反應(yīng)條件惡劣等缺陷；B)采用PEG對重組促紅素的被氧化的糖基進(jìn)行共價(jià)修飾，由于共價(jià)修飾前涉及到糖基化以及糖基氧化的步驟，這類方法同樣存在選擇性差、反應(yīng)不完全的缺陷。WO 90/12874中公開了單甲氧基-PEG-EPO(mPEG-EPO)的制備方法，其中EPO內(nèi)通過基因工程手段導(dǎo)入了一個(gè)半胱氨酸殘基，再將特定的PEG試劑共價(jià)連接到該殘基上。將非天然氨基酸用基因編入法引入蛋白質(zhì)是實(shí)現(xiàn)在單氨基酸殘基水平上選擇性標(biāo)記蛋白質(zhì)的一種非常有效的方法，該方法利用一琥珀型抑制因子tRNA(tRNAraA)通讀一個(gè)存在于mRNA讀碼框內(nèi)的琥珀型終止密碼子(UAG)，在此過程中，氨酰基_tRNA合成酶對該tRNA進(jìn)行了非天然氨基酸酰化，該體系與發(fā)現(xiàn)于一些產(chǎn)(甲)烷古生菌和一種革蘭氏陽性菌(Desulfitobacterium hafniense)細(xì)胞內(nèi)天然進(jìn)行的卩比咯賴氨酸(Pyl)引入機(jī)制相同，在這些生物細(xì)胞內(nèi)，一個(gè)讀碼框內(nèi)的琥珀密碼子對Pyl進(jìn)行共同翻譯并插入蛋白質(zhì)中，這一琥珀密碼子被一類具有CUA反密碼子并且由吡咯賴氨酰基氨酰基-tRNA合成酶(PylRS)進(jìn) 行Pyl酰化的Pyl琥珀型抑制因子tRNA(pylT)所抑制，這些生物體內(nèi)的PylRS-pylT配對體與細(xì)胞內(nèi)其他類型的合成酶-tRNA配對體正交，即無相互作用，因此該配對體只針對Pyl以確保精確引入Pyl。與Pyl引入機(jī)制類似，特定的氨酰基-tRNA合成酶可以將非天然氨基酸特定連接到其同源tRNAo^上,形成正交的合成酶-tRNA·配對體，當(dāng)這一合成酶-tRNAo^配對體在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，非天然氨基酸在琥珀密碼子處被高效、精確地定點(diǎn)引入到蛋白質(zhì)中。這一方法可在細(xì)菌、酵母、及哺乳動物細(xì)胞內(nèi)將多種非天然氨基酸定點(diǎn)引入蛋白質(zhì)，并用以研究大量生物學(xué)課題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)引入了兩種非天然氨基酸，4-乙酰苯丙氨酸(AcF)和2-氨基-8-羰基壬酸(KetoK)，均包含功能性酮基，引入這兩類非天然氨基酸可用于蛋白質(zhì)定點(diǎn)修飾。本專利技術(shù)將這兩類非天然氨基酸引入促紅細(xì)胞生成素(EPO)基因，并成功用于促紅細(xì)胞生成素與帶有羥胺基的20K聚乙二醇(PEG)的共價(jià)連接。本專利技術(shù)提供了兩種化學(xué)修飾的重組促紅細(xì)胞生成素，在第一種重組促紅細(xì)胞生成素中，第65位和/或第152位的氨基酸殘基為4-乙酰苯丙氨酰殘基，至少一個(gè)4-乙酰苯丙氨酰殘基上共價(jià)連接了聚乙二醇；在第二種重組促紅細(xì)胞生成素中，第65位和/或第152位的氨基酸殘基為2-氨-8-氧代壬酰殘基，至少一個(gè)2-氨-8-氧代壬酰殘基上共價(jià)連接了聚乙二醇。本專利技術(shù)還提供了上述化學(xué)修飾的重組促紅細(xì)胞生成素的制備方法，該方法采用基因工程技術(shù)對促紅素進(jìn)行重組，在促紅細(xì)胞生成素的第65位和/或第152位上引入具有化學(xué)活潑酮基的氨基酸殘基，該氨基酸殘基為4-乙酰苯丙氨酰殘基或2-氨-8-氧代壬酰殘基，然后用聚乙二醇對氨基酸殘基進(jìn)行化學(xué)修飾，聚乙二醇特異性地與4-乙酰苯丙氨酰殘基或2-氨-8-氧代壬酰殘基反應(yīng)，反應(yīng)完全且不與其他氨基酸殘基發(fā)生反應(yīng)，所需要的反應(yīng)條件較溫和，解決了現(xiàn)有技術(shù)中選擇性差、反應(yīng)條件惡劣的問題。用來化學(xué)修飾4-乙酰苯丙氨酰殘基或2-氨-8-氧代壬酰殘基的聚乙二醇是一類親水聚合物，優(yōu)選地，羥氨基或聯(lián)氨基取代的聚乙二醇，這類聚乙二醇可以更特異地與4-乙酰苯丙氨酰殘基或2-氨-8-氧代壬酰殘基上的化學(xué)活潑的酮基反應(yīng)，反應(yīng)更完全，所需的反應(yīng)條件很溫和，一般只需要在生理?xiàng)l件下反應(yīng)即可。具有4-乙酰苯丙氨酰殘基的重組促紅細(xì)胞生成素的制備方法包括(I)構(gòu)建含有編碼4-乙酰苯丙氨酰-tRNA合成酶基因、琥珀突變抑制tRNA基因、在第65位和/或第152位發(fā)生琥珀無義突變的促紅細(xì)胞生成素基因的重組表達(dá)載體，編碼4-乙酰苯丙氨酰-tRNA合成酶基因序列如SEQ ID No. 2所述，琥珀突變抑制tRNA基因序列如SEQ ID No. I所述，在第65位發(fā)生琥珀無義突變的促紅細(xì)胞生成素基因序列如SEQID No. 3所述，在第152位發(fā)生琥珀無義突變的促紅細(xì)胞生成素基因序列如SEQ ID No. 4所述；(2)將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞并從中分離得到在第65位和/或第152位具有4-乙酰苯丙氨酰殘基的重組促紅細(xì)胞生成素； (3)采用聚乙二醇對分離得到的所述重組促紅細(xì)胞生成素上的至少一個(gè)4-乙酰苯丙氨酰殘基進(jìn)行化學(xué)修飾。在一種具體實(shí)施方式中,所述重組表達(dá)載體為重組質(zhì)粒pcDNA3. I-Ec本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種化學(xué)修飾的重組促紅細(xì)胞生成素，其中，第152位的氨基酸殘基為2？氨？8？氧代壬酰殘基，所述的2？氨？8？氧代壬酰殘基是通過在促紅細(xì)胞生成素基因序列的第152位發(fā)生琥珀無義突變后由該琥珀無義突變的位置翻譯而成的，在第152位發(fā)生琥珀無義突變的促紅細(xì)胞生成素基因序列如SEQ？ID？No.4所述，所述的2？氨？8？氧代壬酰殘基上共價(jià)連接了聚乙二醇。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種化學(xué)修飾的重組促紅細(xì)胞生成素，其中，第152位的氨基酸殘基為2-氨-8-氧代壬酰殘基，所述的2-氨-8-氧代壬酰殘基是通過在促紅細(xì)胞生成素基因序列的第152位發(fā)生琥珀無義突變后由該琥珀無義突變的位置翻譯而成的，在第152位發(fā)生琥珀無義突變的促紅細(xì)胞生成素基因序列如SEQ ID No. 4所述，所述的2-氨-8-氧代壬酰殘基上共價(jià)連接了聚乙二醇。2.如權(quán)利要求I所述的重組促紅細(xì)胞生成素，其中，所述的聚乙二醇為羥氨基或聯(lián)氨基取代的聚乙二醇。3.制備如權(quán)利要求I所述的重組促紅細(xì)胞生成素的方法，其中，該方法包括 (1)構(gòu)建含有編碼2-氨-8-氧代壬酰-tRNA合成酶基因、琥珀突變抑制tRNA基因、在第152位發(fā)生琥珀無義突變的促紅細(xì)胞生成素基因的重組表達(dá)載體，所述編碼2-氨-8-氧代壬酰-tRNA合成酶基因序列如SEQ ID No. 6所述，所述琥珀突變抑制tRNA基因序列如SEQ IDNo. 5所述，所述在第152位發(fā)生琥...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：萬為，
申請(專利權(quán))人：蘇州元基生物技術(shù)有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：