本發明專利技術公開了一種用高效液相色譜測定白芍愈傷組織中白芍雙苷的方法，包括以下步驟：1）色譜條件：色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相采用乙腈和質量百分數為0.02%~1%的磷酸鉀水溶液，兩者體積比為11：84~94，流動相的流速為0.5mL/min~2mL/min；檢測波長為220nm~240nm；柱溫為10℃~35℃；2）測定：將白芍愈傷組織制成的樣品溶液注入高效液相色譜儀，按步驟1）的色譜條件測定，同步測定白芍愈傷組織中芍藥苷和芍藥內酯苷的含量。本發明專利技術方法具有測定結果準確、檢測過程快速、方便，時間短，操作簡單等優點，為白芍愈傷組織培養和分析控制奠定了基礎。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及分析化學方法領域，特別涉及一種用液相色譜法同步檢測白芍愈傷組織中白芍雙苷各自含量的方法。
技術介紹
白芍為毛茛科植物芍藥的干燥根，是常用中藥材之一，具有收斂止血、消腫生肌、養血柔肝、緩中止痛、斂陰收汗之功效。白芍的主要有效成分為芍藥苷、芍藥內酯苷、氧化芍藥苷和苯甲酰芍藥苷等單萜苷類，其中芍藥苷和芍藥內酯苷合稱為白芍雙苷，是白芍提取物中的主要有效成分?，F代藥理實驗表明，白芍雙苷具有多途徑抑制自身免疫反應，以及抗炎、止痛、保肝和抑制自身免疫等多種藥理作用，對類風濕性關節炎有確切療效，以白芍雙苷為主要成分的白芍總苷膠囊已用于類風濕性關節炎的臨床治療。 傳統的白芍雙苷生產方法是從中藥材白芍中提取。由于芍藥種植時間長、白芍藥材中白芍雙苷含量低，導致白芍雙苷的生產量低、生產成本高，白芍雙苷的應用受到了限制。為了解決這一問題，人們目前已開始嘗試通過芍藥愈傷組織的大規模培養來進行白芍雙苷的規?；苽?。為了了解不同的愈傷組織培養條件對愈傷組織中白芍雙苷含量的影響、確定最有利于白芍雙苷產生的愈傷組織培養條件，有必要準確測定白芍愈傷組織中白芍雙苷的含量。高效液相色譜是一種常用的測定方法，它具有分析速度快，樣品用量少，靈敏度高的優點。目前，已有人采用高效液相色譜法來測定白芍藥材中白芍雙苷含量的測定，以評判白芍的品質、了解芍藥種植和炮制條件的優劣，指導白芍的加工、銷售和使用。例如，文獻“超高效液相色譜法同時測定白芍中芍藥苷和芍藥內酯苷的含量”(中南藥學2012年2月第10卷第2期，第98 100頁)公開了一種采用高效液相色譜法同時測定白芍中芍藥苷和芍藥內酯苷的含量的方法，采用以下色譜條件色譜柱=Agilent EXTEND-C18 (4. 6nmX50mm,1.8 μ m);流動相:乙腈(A) -O. 2%乙酸溶液(B);梯度洗脫:0 2· 5min，8% 12%A，2. 5 lOmin，12% 20%A ;流速0. 5mL .mirT1 ;檢測波長230nm ;溫度30°C ;進樣量4μ L。配制對照品溶液和供試品溶液，在上述的色譜條件下，該技術方案可在8min內實現對白芍中芍藥苷和芍藥內酯苷兩種物質含量同時測定。但迄今為止，在國內外還未見測定白芍愈傷組織中白芍雙苷含量的方法。由于白芍愈傷組織的培養條件完全不同于芍藥白芍的生長條件，愈傷組織的性質與白芍存在較大差異，白芍愈傷組織中各種物質的組成、含量也與白芍中物質的組成和含量存在不同，利用這些以檢測白芍中白芍雙苷含量為目標的方法來測定愈傷組織中白芍雙苷的含量時發現物質的分離度差、檢測效果不佳，說明這些方法不適用于愈傷組織中白芍雙苷的檢測。因此，建立一種應用高效液相色譜法測定白芍愈傷組織中芍藥雙苷的含量的方法是十分必要的。
技術實現思路
本專利技術提供了，檢測過程快速、方便，時間短，操作簡單。，包括以下步驟I)色譜條件色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相采用乙腈和質量百分數為O. 02°/Γ %的磷酸鉀水溶液，兩者體積比為11 :84、4，流動相的流速為O. 5mL/mirT2mL/min ；檢測波長為220nnT240nm ;柱溫為10°C "35°C ；2)測定 將白芍愈傷組織制成的樣品溶液注入高效液相色譜儀，按步驟I)的色譜條件測定，同步測定白芍愈傷組織中芍藥苷和芍藥內酯苷的含量。雖然
技術介紹
中的文獻所公開的方法(以下簡稱“對比方法”)和本專利技術都采用了反相色譜對芍藥苷和芍藥內酯苷的含量進行檢測，但兩者間存在實質性差別。具體體現在以下幾點對比方法采用的流動相是乙腈(A) -O. 2%乙酸溶液(B)，本專利技術方法采用的是乙腈(A) -O. 02°/Γ %的磷酸鉀水溶液(B)。與O. 2%的乙酸相比，O. 02°/Γ %的磷酸鉀水溶液具有更好的PH值緩沖能力，在樣品的pH值發生較大范圍的波動時，采用O. 02°/Γ %的磷酸鉀水溶液可以更好地保持流體體系的PH值穩定性，而pH值的穩定可以使各物質的洗脫能力保持穩定，從而使檢測結果具有更好的重現性，從而能更準確地比較不同樣品中白芍雙苷含量的高低；對比方法采用的流動相洗脫方式為梯度洗脫，即在洗脫的不同階段，流動相A和流動相B的比例不同；而本專利技術方法采用的流動相洗脫方式為淌洗，即在洗脫的整個階段，流動相中A和B的比例保持不變。一般說來，采用梯度洗脫可以獲得比淌洗更好的分離效果，多用于成分復雜、難以有效分離的樣品。對比方法由于采用乙酸作為流動相，對樣品的PH值調控能力較差，因此，需要采取梯度洗脫；而本專利技術由于采用了磷酸鉀水溶液作為緩沖液，不僅可以保證檢測體系的PH值穩定性，而且鉀離子的存在還可以使檢測峰的峰型更尖銳、分離度更高，因此，只需要采用淌洗就可以達到滿意的分離效果。這不僅從另一個方面表明了本專利技術方法在流動相選擇上優于對比方法的流動相，而且也可以使檢測變得更簡單。眾所周知，采用梯度洗脫時，必須采用至少兩個泵才能實現，因而所用的高效液相色譜儀必須至少配備二元泵；而采用淌洗時，只需配備一元泵即可。因此，本專利技術方法對檢測設備的要求更簡單，可以在最簡單的設備條件下實現對白芍愈傷組織中白芍雙苷含量的準確檢測，應用更為方便。作為優選，步驟I)中，采用的流動相洗脫方式為淌洗，本專利技術由于采用了磷酸鉀水溶液作為緩沖液，不僅可以保證檢測體系的PH值穩定性，而且鉀離子的存在還可以使檢測峰的峰型更尖銳、分離度更高，因此，只需要采用淌洗就可以達到滿意的分離效果。流動相采用乙腈和質量百分數為O. 02% 1%的磷酸鉀水溶液，兩者體積比為11 84、4，該流動相的pH變化范圍為4. (Γ4. 8，可以保證檢測體系的pH值穩定性。作為優選，步驟I)中，色譜柱采用4. 6mmX250mm、粒度為5μπι的十八烷基硅烷鍵合硅膠柱，使用該種具體型號的色譜柱具有較好的檢測效果，測試的精密度、穩定性較好。步驟2)中，所述的樣品溶液的制備具體包括取白芍愈傷組織檢測樣品粉末用純甲醇或質量百分數709Γ99. 99%的甲醇水溶液浸潰后，再在40°C 80°C下超聲處理15 45min后，在800(Tl2000rpm (轉/分鐘)離心l(T30min，取上清液經O. 15^0. 3 μ m的微孔濾膜濾過，得到樣品溶液。經過上述方法制備的樣品溶液能夠更好地保證檢測精密度，并且，檢測穩定性較好，從而有利于測定白芍愈傷組織中芍藥苷和芍藥內酯苷的含量。所述的白茍愈傷組織檢測樣品粉末由白茍愈傷組織檢測樣品經過研磨制成。所述的白芍愈傷組織檢測樣品應做廣義的理解，并不僅限于白芍愈傷組織，所述的白芍愈傷組織檢測樣品包括白芍愈傷組織干品以及白芍愈傷組織制成的食品、保健品和藥物。所述的白芍愈傷組織干品通過白芍愈傷組織在70V 90°C的烘箱內烘干制得，該烘干條件能夠較好地保留白芍愈傷組織中的芍藥苷和芍藥內酯苷，并能夠起到烘干的作 用。進一步優選，I)色譜條件色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相采用乙腈和質量百分數為O. 05%的磷酸鉀水溶液，兩者體積比為11 :89，流動相的流速為lmL/min ;檢測波長為230nm;柱溫為 25 °C。該色譜條件能夠提高同步測定白芍愈傷組織中白芍雙苷的含量的檢測精密度，并且使得檢測具有更好的穩定性和重復性。進一步優選，所述的樣品溶本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種用高效液相色譜測定白芍愈傷組織中白芍雙苷的方法，其特征在于，包括以下步驟：1）色譜條件：色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相采用乙腈和質量百分數為0.02%~1%的磷酸鉀水溶液，兩者體積比為11：84~94，流動相的流速為0.5mL/min~2mL/min；檢測波長為220nm~240nm；柱溫為10℃~35℃；2）測定：將白芍愈傷組織制成的樣品溶液注入高效液相色譜儀，按步驟1）的色譜條件測定，同步測定白芍愈傷組織中芍藥苷和芍藥內酯苷的含量。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：江海龍，馮定軍，俞偉，梅樂和，胡升，代冬梅，周海濱，
申請(專利權)人：寧波立華制藥有限公司，浙江大學寧波理工學院，
類型：發明
國別省市：
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