本發明專利技術公開了一種利用液相色譜檢測系統定量口蹄疫抗原146S含量的方法，包括：首先用硫酸魚精蛋白純化病毒，然后用PEG6000濃縮病毒，濃縮后的病毒進行蔗糖密度梯度超速離心，使用液相色譜檢測系統檢測離心后樣品在波長259nm處的吸收峰，最后根據公式C＝FRS/76Wb計算出146S的含量。本發明專利技術方法可用于各型口蹄疫抗原146S含量的測定，通過定量口蹄疫抗原中146S的含量能夠指導口蹄疫疫苗的配制，間接評價疫苗的效力，這對于提升我國口蹄疫疫苗質量具有重大指導意義。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種定量口蹄疫抗原中146S含量的檢測方法，特別涉及一種利用液相色譜檢測系統定量蔗糖密度梯度離心樣品中口蹄疫抗原146S含量的方法。屬于生物檢測領域。
技術介紹
在口蹄疫病毒樣品中，存在4種大小不同的病毒粒子，最大的為完整病毒粒子，沉降系數為146S，稍小的一種顆粒為空衣殼，沉降系數為75S，還有一種為衣殼蛋白亞單位，沉降系數為12S，最小的一種為VIA抗原，沉降系數為3 4. 5S。在動物免疫中，與刺激機體產生抗體和致敏淋巴細胞有關的主要是口蹄疫146S抗原，146S含有口蹄疫病毒所有的中和位點，是口蹄疫病毒的有效抗原成分。動物只有免疫足夠的146S抗原才能有效的刺激機體的免疫系統，產生良好的體液免疫和細胞免疫。146S的含量是評價疫苗質量好壞的一個重要標準，目前已經報道的口蹄疫抗原定量檢測技術主要有1.細胞半數感染量(TCID50)測定2.補體結合試驗(CFT) 3. ELISA定量口蹄疫146S含量4.蛋白層析分析法5.熒光定量PCR進行疫苗中抗原含量的定量等。方法I是對病毒核酸進行檢測，除測定完整病毒粒子外，還測定了 146S裂解產物的核酸，不能完全反映病毒的免疫原性，也不能測定滅活后病毒樣品；方法2準確性、敏感性不好，且不能很好的區分146S和12S ;方法3需針對不同型的病毒分別篩選單克隆，成本較高周期較長，目前沒有商品化的產品，僅限于學術研究；方法4，5成本較高，操作復雜，在實際生產中實用性較低。建立一種快速準確的146S抗原定量檢測方法，對于提高疫苗的生產效率和質量控制具有重要意義。中國專利公開號CN101655452A，公開日為2010年2月24日，專利技術創造名稱為“蔗糖密度梯度紫外光定量檢測口蹄疫抗原146S含量的方法”，該申請案公開了一種利用蔗糖密度梯度離心紫外光定量檢測口蹄疫抗原146S含量的方法，其不足之處在于首先該專利技術的前期樣品處理工藝復雜，而且沒有充分去除樣品中的雜蛋白和核酸，影響下一步定量的準確性；其次，計算公式所需參數繁雜，沒有檢測圖譜輔以支持，而且國內外的連續流紫外光度計難以滿足該公式的需求參數，應用受限。本專利技術的方法利用液相色譜檢測系統在259nm處連續檢測蔗糖密度梯度離心樣品，146S含量計算公式簡便；與現有授權專利比較，本方法采用硫酸魚精蛋白先去除部分雜蛋白和核酸，又經PEG6000濃縮進一步去除絕大部分的雜蛋白和核酸，兩者的結合極大的避免了雜蛋白和核酸在259nm處的紫外吸收對146S吸收峰的影響，而且經過硫酸魚精蛋白處理后，去除了大部分的核酸，避免了因核酸粘稠病毒重懸不徹底造成的誤差，進一步提高了 146S含量測定的準確性；使用精度和準確性較高的液相色譜檢測系統，使得超速離心后樣品的檢測更加精確和快捷，根據朗博-比爾定律及定積分原理，得出計算公式，該公式需四個參數樣品通過樣品池的流速、檢測系統樣品池光程長度、146S吸收峰面積和上樣量，樣品池光程是既定已知的，樣品通過樣品池的流速和上樣量都是可控的，146S吸收峰面積由色譜工作站自動生成。采用這種方法可以精確、快速地測定口蹄疫抗原樣品中146S含量，可以用于監測生產過程中病毒抗原的含量，指導疫苗配制并間接評價疫苗效力。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是提供一種口蹄疫抗原146S含量定量檢測的方法，本專利技術的方法其特征在于包括以下步驟(I)病毒純化向待測的口蹄疫病毒樣品中加入硫酸魚精蛋白，使加入的硫酸魚精蛋白的終濃度為0. 5 2. Omg/ml,室溫作用0. 5 2h, 5000 IOOOOrpm離心15min lh，分離得到上清液；所述的口蹄疫病毒為任何型或亞型的口蹄疫病毒毒株或其滅活毒株。 在本專利技術的具體實施例中，所述的口蹄疫病毒毒株為牛Asia I/JSL/GSZY/06毒(Asia I/JQ株空衣殼疫苗對Asia I型FMDV兩株不同毒株免疫效果的測定，李志勇等，首屆中國獸藥大會一一獸醫生物制品學、獸醫微生物學學術論壇論文集(2008))、牛0型0NXC/92毒(口蹄疫病毒0型-Asia I型二價滅活疫苗毒種種子批的建立(I)，徐春河等，中國畜牧獸醫學會口蹄疫學分會第十一次學術研討會會議論文)、豬0型0/ZK/93毒(豬口蹄疫0型滅活疫苗0ZK/93株與0ZK/93株+0S/99株免疫效果對比試驗，徐新紅等，飼料與畜牧 規模養豬2010，(9))購買自蘭州獸醫研究所；(2)PEG6000濃縮病毒按質量體積百分比計，向獲得的上清液中加入NaCl，使NaCl的終濃度為2 6%，充分溶解后加入PEG6000，使PEG6000的終濃度為5 10%，2 8°C下攪拌混合I 16h，5000 IOOOOrpm離心I 2h，獲得口蹄疫病毒沉淀，使用TEN緩沖液重懸病毒沉淀，得到病毒濃縮液；(3)蔗糖密度梯度超速離心制備質量體積比(g/ml)為15% 45% (即蔗糖濃度為15 45g/100ml)的均勻線性蔗糖梯度液，將步驟(2)得到的病毒濃縮液進行蔗糖密度梯度超速離心，6 10°C, 30000 40000rpm,離心2. 5 3. 5h,得到超速離心樣品；(4)液相色譜檢測系統檢測將步驟(3)得到的超速離心樣品連續通過液相色譜檢測系統，對超速離心樣品在波長259nm處的吸收值進行連續檢測，得到超速離心樣品在波長259nm處的吸收圖譜；優選的，本專利技術所用液相色譜檢測系統系統應使用準確性較高，光源穩定、波長精確度高的檢測器，并配套有相應的自動分析軟件(即色譜工作站)；恒流泵應使用壓力穩定、精確度高、消除脈沖的穩壓恒流泵。在本專利技術的一個具體實施例中，所使用液相色譜檢測系統購自萊伯泰科公司，是由液相色譜檢測器、色譜工作站和恒流泵組成，液相色譜檢測器型號為UV600紫外-可見可變波長檢測器，恒流泵型號為P600高壓恒流泵。(5)計算146S含量根據液相色譜工作站所測得的146S在259nm處的吸收峰面積，由以下公式計算出146S的含量，C = FES/76ffb上述公式中，C為樣品中146S含量；Fk為樣品通過樣品池的流速；S為液相色譜工作站在波長259nm處所檢測樣品中146S的吸收峰面積；W為加在梯度液上的病毒樣品的體積山為流動樣品池的光程長度。根據本專利技術的一個優選實施例，步驟(I)中使加入的硫酸魚精蛋白的終濃度為lmg/ml,室溫作用Ih。根據本專利技術的一個優選實施例，步驟(I)中所述的離心轉速為7000rpm，離心30mino根據本專利技術的一個優選實施例，步驟(2)中按質量體積百分比(g/ml)計，向獲得的上清液中加入NaCl，使其終濃度為4% (即IOOml上清液中所加入的NaCl為4g)，充分溶解后加入PEG6000，使其終濃度為8% (即IOOml上清液中所加入的PEG6000為8g)，4°C攪拌混合2 6h，7000rpm離心lh，獲得口蹄疫病毒沉淀。根據本專利技術的一個優選實施例，步驟(2)中所述的TEN緩沖 液為含有0. OlMTris,0. OlM EDTA,0.1M NaCl 的溶液，PH 為 7. 6 8. 0.根據本專利技術的一個優選實施例，用所述的TEN緩沖液重懸病毒沉淀，得到的體積為病毒樣品體積1/100-1/50病毒濃縮液，更優選為用所述的TEN緩沖液重懸病毒沉淀，得到本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種利用液相色譜檢測系統定量測定口蹄疫抗原中146S含量的方法，其特征在于包括以下步驟：(1)病毒純化：向待測的口蹄疫病毒樣品中加入硫酸魚精蛋白，使加入的硫酸魚精蛋白的終濃度為0.5～2.0mg/ml，室溫作用0.5～2h，5000～10000rpm離心15min～1h，分離得到上清液；(2)PEG6000濃縮病毒：按質量體積百分比計，向獲得的上清液中加入NaCl，使NaCl的終濃度為2～6％，充分溶解后加入PEG6000，使PEG6000的終濃度為5～10％，2～8℃下攪拌混合1～16h，5000～10000rpm離心1～2h，獲得口蹄疫病毒沉淀，使用TEN緩沖液重懸病毒沉淀，得到病毒濃縮液；(3)蔗糖密度梯度超速離心：制備質量體積比為15％～45％的均勻線性蔗糖梯度液，將步驟(2)得到的病毒濃縮液進行蔗糖密度梯度超速離心，6～10℃，30000～40000rpm，離心2.5～3.5h，得到超速離心樣品；(4)液相色譜檢測系統檢測：將步驟(3)得到的超速離心樣品連續通過液相色譜檢測系統，對超速離心樣品在波長259nm處的吸收值進行連續檢測，得到超速離心樣品在波長259nm處的吸收圖譜；(5)計算146S含量：根據液相色譜工作站所測得的146S在259nm處的吸收峰面積，由以下公式計算出146S的含量，C＝FRS/76Wb上述公式中，C為樣品中146S含量；FR為樣品通過樣品池的流速；S為液相色譜工作站在波長259nm處所檢測樣品中146S的吸收峰面積；W為加在梯度液上的病毒樣品的體積；b為流動樣品池的光程長度。...
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：倪春霞，徐樹蘭，李少英，趙炳武，辛俊寶，張澍，王欽富，武華，
申請(專利權)人：內蒙古必威安泰生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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