一種用于檢測溶血性鏈球菌的核酸適體、互補序列及檢測方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種用于檢測溶血性鏈球菌的核酸適體、互補序列及檢測方法，本發(fā)明專利技術(shù)屬于臨床檢驗領(lǐng)域及食品檢測領(lǐng)域，本發(fā)明專利技術(shù)設(shè)計了連接有FAM熒光信號的與溶血性鏈球菌特異性結(jié)合的核酸適體，及與其互補的寡核苷酸序列，建立了用于檢測溶血性鏈球菌的以膠體金淬滅熒光為基礎(chǔ)的核酸適體生物傳感器檢測方法，本發(fā)明專利技術(shù)主要用于溶血性鏈球菌的快速檢測，具有特異性強、靈敏度高、檢測效率高、操作簡單且安全性高的優(yōu)點。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于臨床檢驗領(lǐng)域、食品檢測領(lǐng)域，具體涉及一種以膠體金的熒光淬滅為基礎(chǔ)的核酸適體、互補序列及檢測溶血性鏈球菌的方法。
技術(shù)介紹
溶血性鏈球菌呈球形或橢圓形 ，直徑O. 6-1. O μ m,呈鏈狀排列，長短不一，從4-8個至20-30個菌細胞組成不等，鏈的長短與細菌的種類及生長環(huán)境有關(guān)。該菌不形成芽胞，無鞭毛，易被普通的堿性染料著色，革蘭氏陽性，老齡培養(yǎng)或被中性粒細胞吞噬后，轉(zhuǎn)為革蘭氏陰性。該菌為需氧或兼性厭氧菌，營養(yǎng)要求較高，普通培養(yǎng)基上生長不良，需補充血清、血液、腹水，大多數(shù)菌株需核黃素、維生素B6、煙酸等生長因子。最適生長溫度為37°C，在20-42°C能生長，最適pH為7.4-7.6。在血清肉湯中易成長鏈，管底呈絮狀或顆粒狀沉淀生長。在血平板上形成灰白色、半透明、表面光滑、邊緣整齊、直徑O. 5-0. 75mm的細小菌落，不同菌株溶血程度不一。溶血性鏈球菌在自然界中分布較廣，存在于水、空氣、塵埃、糞便及健康人和動物的口腔、鼻腔、咽喉中，可通過直接接觸、空氣飛沫傳播或通過皮膚、粘膜傷口感染，被污染的食品如奶、肉、蛋及其制品也會對人類進行感染。一般來說，溶血性鏈球菌常通過以下途徑污染食品1、食品加工或銷售人員口腔、鼻腔、手、面部有化膿性炎癥時造成食品的污染；2、食品在加工前就已帶菌、奶?；蓟撔匀橄傺谆蛐笄菥植炕摃r，其奶和肉尸某些部位污染；3、熟食制品因包裝不善而使食品受到污染。溶血性鏈球菌是一種常見的病原微生物，可引起食物中毒與臨床感染，感染人體可導(dǎo)致新生兒敗血癥、腦膜炎、肺炎等多種嚴重感染性疾病，甚至死亡。溶血性鏈球菌感染具有傳染源廣，危害大等特點，同時該菌的自然來源較廣。其相關(guān)檢測技術(shù)較繁瑣，檢測周期長，按照國家食品微生物檢測標準GB4789程序培養(yǎng)檢測需要3天時間，同時儀器設(shè)備硬件要求高。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，現(xiàn)在已建立了以PCR為基礎(chǔ)的多項檢測技術(shù)如免疫PCR、實時定量PCR、多重PCR，及以抗原檢測為主的免疫學(xué)檢測法。針對溶血性鏈球菌scpA基因設(shè)計特異性LAMP擴增引物，進行等溫擴增，能有效地檢出致病性溶血性鏈球菌。這些檢測方法快捷、靈敏，準確度較高。但是，這些針對單一族溶血性鏈球菌的現(xiàn)代檢測方法均需一定的設(shè)備和技術(shù)要求，且試劑費用較貴，難以推廣普及。因此，建立溶血性鏈球菌特別是致病性菌株的準確快速檢測對于控制該類細菌引起的食物中毒具有重要意義因此進一步探索該菌的快速、靈敏的檢測方法對食品中該菌的污染監(jiān)測、該菌的疾病診斷和流行病學(xué)調(diào)查顯得尤為重要。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供以膠體金淬滅熒光為基礎(chǔ)的，本專利技術(shù)的方法能快速、特異、靈敏地檢測溶血性鏈球菌。為實現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)采取的技術(shù)方案為一種用于檢測溶血性鏈球菌的核酸適體及其互補序列，核酸適體的序列命名為序列A，互補序列命名為序列B，具體序列如下序列A :5，-CAGATGCACACGCTGAAGAAACTGAGGTCGTAGGTTTTCTTCGGG-3’ ；序列B :5，-CGTGTGCATCTGAAAAAAAAAA-SH3，；其中序列A的5’端有突光報 告基團。進一步的，所述的熒光報告基團為FAM。本專利技術(shù)還提供了一種用于檢測溶血性鏈球菌的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟I)采用常規(guī)方法制備納米金顆粒；2)納米金顆粒與互補序列反應(yīng)，形成互補寡核苷酸的納米金顆粒覆蓋體；3))將步驟2制備的互補寡核苷酸的納米金顆粒覆蓋體，與權(quán)利要I或2所述的核酸適體反應(yīng)，覆蓋體上的納米金顆粒猝滅核酸適體上的熒光報告基團發(fā)出的熒光信號；4)在步驟3的反應(yīng)體系中，加入溶血性鏈球菌，溶血性鏈球菌與核酸適體特異性結(jié)合，使其與覆蓋有納米金顆粒的互補寡核苷酸分離，釋放出的核酸適體標記的熒光基團使熒光信號重新恢復(fù)。用熒光分光光度計測量熒光信號強度以檢測溶血性鏈球菌的量，其最低檢測限為33CFU/ml。本專利技術(shù)采用納米金顆粒與核酸適體序列結(jié)合快速檢測溶血性鏈球菌的原理利用與溶血性鏈球菌特異性結(jié)合的單鏈DNA核酸適體既可以與靶蛋白特異結(jié)合又能與互補寡聚核苷酸形成雙鏈的特點，利用納米金顆粒猝滅熒光染料的特點，通過將溶血性鏈球菌引入到體系中后熒光信號的改變，用熒光分光光度計測量熒光信號強度來實現(xiàn)對溶血性鏈球菌的分析。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)具有如下有益效果I)特異性強本專利技術(shù)尋找并合成了與溶血性鏈球菌特異性結(jié)合的帶有熒光報告基團FAM的核酸適體。并用阪崎腸桿菌、銅綠假單胞菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌作為對照菌株。此核酸適體僅與溶血性鏈球菌有高特異性結(jié)合，與其他對照菌株結(jié)合較弱。因此能對溶血性鏈球菌進行特異性檢測。2)靈敏度高最低檢測限為33cfu/ml。3)檢測效率高檢測周期由國標方法(GB4788. 11-2003)的3天縮短為增菌24h后歷經(jīng)30min左右孵育反應(yīng)，檢測時間短，且可同時檢測多個樣品，檢測量大。4)操作簡單操作步驟簡單，結(jié)果直接客觀，對操作人員要求不高。5)安全性高不需用到有毒害的試劑，對操作人員有一定的保護性。附圖說明圖1納米金顆粒的透射電鏡照片。圖2溶血性鏈球菌和標記熒光的核酸適體結(jié)合激發(fā)熒光光譜。圖3不同濃度溶血性鏈球菌與標記熒光的核酸適體結(jié)合激發(fā)熒光光譜。圖4不同細菌與標記熒光的核酸適體結(jié)合激發(fā)熒光光譜。圖5以Logltl 為X軸，最大熒光強度為Y軸繪制的校正曲線。具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例對本專利技術(shù)作進一步詳細說明。實施例一1、實驗材料1.1熒光分光光度計測量(日本日立公司F7000);透射電子顯微鏡(JEM-1230，JEOL，Japan) ;pH 計(上海 REX 儀器廠) 1. 2培養(yǎng)基腦心浸液肉湯、血平板由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn)。1. 3菌種溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、銅綠假單胞菌、阪崎桿菌。2、合成了一條能與溶血性鏈球菌特異性結(jié)合的標記了 FAM的核酸適體序列；同時合成了一條DNA靶序列的互補序列。3、樣品處理生物安全柜中按GB4789. 11-2003要求進行樣品稀釋及增菌，樣品增菌液于37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h.4、使用的陽性對照菌株為β -溶血溶血性鏈球菌，陰性對照菌株為阪崎桿菌、銅綠假單胞菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌。將上述菌種分別接于腦心浸液肉湯培養(yǎng)基中，36°C培養(yǎng)24h。取β -溶血溶血性鏈球菌培養(yǎng)液1ml，進行10倍比稀釋，得到IOc1-1O8系列稀釋度的菌懸液，分別從不同稀釋度的菌懸液中取lml，涂布于血平板，計算菌液的密度。剩下的培養(yǎng)液IOOOOrpm,離心lOmin。其他的陰性菌株也按上述方法培養(yǎng),離心,但不做計數(shù)。5、合成納米金顆粒檸檬酸鈉(38. SmM ;50毫升)迅速添加到沸騰的氯金酸(I毫米，250毫升)。不停地攪拌煮沸15分鐘。在5分鐘內(nèi)溶液的顏色從淺黃色變成深紅色，讓其冷卻至室溫。制備的納米金顆粒存放在4°C。通過透射電子顯微鏡檢測納米金顆粒的濃度。透射電鏡拍攝納米金顆粒，納米金顆粒的平均直徑為17. 94±O. lnm，結(jié)果見圖1。6、將納米金顆粒與互補的寡核苷酸反應(yīng)O. 50D巰基化的DNA適體加入ImllOnM的的納米金顆粒。16小時后，將2M NaCl溶液慢慢加入混合物，放置8h ;隨后加入O. 2M NaCl，放置8h ;再加入O.1M Na本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種用于檢測溶血性鏈球菌的核酸適體及其互補序列，其特征在于：核酸適體的序列命名為序列A，互補序列命名為序列B，具體序列如下：序列A：5’?CAGATGCACACGCTGAAGAAACTGAGGTCGTAGGTTTTCTTCGGG?3’；序列B：5’?CGTGTGCATCTGAAAAAAAAAA?SH3’；其中序列A的5’端標記有熒光報告基團。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：彭新凱，李樂，聶靜苑，鐘菲菲，劉子音，黃亮，楊麗霞，夏立新，
申請(專利權(quán))人：湖南省食品安全生產(chǎn)工程技術(shù)研究中心，
類型：發(fā)明
國別省市：