堿性艷蘭BO在DNA檢測中的應用制造技術

本發明專利技術涉及堿性艷蘭BO(Victoria?pure?blue?BO，VPBBO)在瓊脂糖凝膠上對DNA染色的方法，其中染色液為pH為6-8的含堿性艷蘭BO的溶液。另外，本發明專利技術還涉及基于上述方法的在瓊脂糖凝膠上檢測DNA的方法以及用于這些方法的試劑盒等。本發明專利技術具有靈敏度高、操作簡單迅速、重現性好、染色背景低、線性范圍廣、可逆性強、使用安全、成本低廉等優點。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物檢測
，具體而言，本專利技術涉及堿性艷蘭BO(VPBBO)在瓊脂糖凝膠上對DNA染色的方法，其成本低、步驟簡單、操作時間短、靈敏度高而且染色后的背景顏色淺。另外，本專利技術還涉及檢測DNA的方法以及用于這些方法的試劑盒等。
技術介紹
在生命科學研究領域中，作為生物體內的重要大分子，DNA是研究生命現象與本質的物質基礎，其主要功能是儲存、傳遞和表達生物體的遺傳信息，DNA與生命的異常現象的發生和遺傳性疾病等緊密關聯。近年來隨著基因組學、功能基因組學和結構基因組學的快速發展，它的應用范圍越來越廣，幾乎滲透到生命科學的各個領域。因此，如何進一步研究 和發展高靈敏度、高選擇性和簡便快捷的DNA測定新體系與新方法，自然成為分析研究工作者關注的研究方向。目前，瓊脂糖凝膠電泳是高效分離和分析DNA分子的一種常用方法，使得凝膠上DNA的檢測技術對DNA的相關研究起著至關重要的作用。測定DNA含量的方法有多種，目前用于瓊脂糖上DNA研究和測定的方法有熒光染色法、染料染色法、負染法、銀染法等。DNA熒光檢測法因具有快速便捷、靈敏度高等優點而成為常用的DNA檢測方法之一，其使用諸如溴化乙錠(EB)、SYBR green、SYBR gold等熒光染料，如紫外光線(UV)的照射下發出熒光，可用于檢測瓊脂糖凝膠上的DNA條帶。然而，這些熒光染料都具有一些不可克服的缺點，尤其是EB，由于其能嵌入DNA分子雙螺旋結構中，可破壞DNA樣品，從而具有較強的致畸致突變作用，對實驗操作者具有潛在危險；此外EB檢測的凝膠需要在紫外燈下進行檢識，而紫外射線常常導致核酸雜交、聚合，對其結構產生影響。，同時熒光檢測儀器設備成本也比較高。因此，肉眼可見、操作簡單、無毒、低成本的可視有機染料成為替代熒光染料為DNA染色的選擇之一。已經有一些報道公開了可視有機染料用于瓊脂糖凝膠上DNA的染色方法，如亞甲藍、亮甲酚藍、結晶紫、以及尼羅河藍等。但是，這些染料染色和脫色時間長，而且靈敏度較低，普遍不如熒光染料。為此，本專利技術人經過長期實踐研究，令人驚訝地在發現成本低的堿性艷蘭BO (Victoria pure blue B0,VPBB0)可用于在瓊脂糖凝膠上對DNA染色，其可以在10分鐘的染色時間內檢測出低至0.8-1. 6ng級的DNA，靈敏度是尼羅藍(NB)的四倍，近似EB等熒光染料的靈敏度。另外，本專利技術人還專利技術了基于上述染色法的檢測DNA的方法以及用于這些方法的試劑盒等。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供VPBBO染色法，其能對在瓊脂糖凝膠中的DNA染色，該方法安全、操作方便、成本低，而且靈敏度高。另外，本專利技術的目的還在于提供檢測DNA的方法以及用于這些方法的試劑盒等。VPBBO是一種無毒性的萘基二苯甲烷類染料，其結構式如圖1所示。本專利技術人經研究發現，VPBBO的分子結構和DNA分子具有很強的親和力，但是VPBBO分子結構和瓊脂糖結合的能力則弱得多，從而能夠使DNA (相對于瓊脂糖凝膠基質)顯出顏色。優選在本專利技術的第一方面中，所述染色液中堿性艷蘭BO的濃度為0.001%至0.01%，優選為0.003%至0.008%，最優選為0.005%。本專利技術人經研究發現，VPBBO濃度過低，則染色后的顏色強度會有下降，而濃度過高，VPBBO會使背景也過多地染上色，從而降低圖像的對比度，如圖2。另外，在本文中如未特別指出，所述“溶液”均為水溶液，即溶劑為水，優選明示出其中所含的溶質為所述溶液中的全部溶質；也優選對于液體溶質來說，其百分比濃度指的是體積百分比濃度，而對于固體溶質來說，其百分比濃度指的是質量百分比濃度。在現有的染色方法中，有機溶劑常用來作為染色的介質或固定劑，用以提高染色強度，從而提高靈敏度。本專利技術人經研究發現，加入有機溶劑乙醇能更好的溶解VPBBO并能有效提高瓊脂糖凝上的DNA染色強度。所述染色液中乙醇濃度為5%至50%，優選5%至·20%，最優為10%。優選所述有機溶劑選自甲醇、乙醇、甘油和丙二醇之一或多種。在現有的染色方法中，無機鹽常用來降低凝膠背景上染色的程度。本專利技術人經研究發現，加入無機鹽NaHCO3后可使凝膠背景上的染色強度達到最強。所述染色液中NaHCO3濃度為0. 01 %至5%，優選0. 05%至I %，最優為0.1 %。優選所述無機鹽選自NaHC03、NaCl、MgCl2、ZnCl2和(NH4)2SO4之一或多種。最優選，本專利技術第一方面所述的方法中所述的染色液是VPBBO的溶液，其中溶質含VPBBO和NaHCO3,溶劑為含10%乙醇的水溶液。染色后，需將瓊脂糖凝膠進行脫色，以洗去其表面殘留的染色液，然后用于觀察結果。優選在本專利技術的第一方面，所述方法包括在染色后洗滌的步驟。更優選本專利技術第一方面所述的方法由將瓊脂糖凝膠浸入含堿性艷蘭BO的染色液中染色的步驟和在染色后洗滌的步驟組成。在本文中，“洗滌”指的是用溶劑清洗瓊脂糖凝膠，用以洗去上一步驟殘留在瓊脂糖凝膠上的試劑。其中，優選溶劑是醇、水、生理鹽水或緩沖液，如Tris-HCl緩沖液、PBS緩沖液等。洗滌的時間為I至30分鐘，優選是I分鐘至10分鐘。優選洗滌是先用醇洗然后用水洗。在本專利技術的具體實施方式中，先用40%乙醇溶液，I %冰醋酸水溶液沖洗2-3分鐘，接著用去離子水清洗I分鐘。在本專利技術的第一方面中，染色的時間為至少5分鐘。本專利技術人研究發現，染色的時間可以不必過長。因此出于節約操作時間的考量，優選在本專利技術的第一方面中，染色的時間優選為5至240分鐘，更優選為10至45分鐘，最優選為10分鐘。在第二方面，本專利技術的目的在于提供用于本專利技術第一方面所述方法的試劑盒，其包括分裝的PH為6-8的含堿性艷蘭BO的染色液。所述試劑盒還可以包括分裝的醇，如40%乙醇，I %冰醋酸溶液。更優選所述試劑盒中染色液中各組分的含量如本專利技術第一方面所優選的那樣。盡管不優選，但是所述試劑盒還可以包括分裝的水，如去離子水。在本文中，試劑盒具有本領域技術人員所能理解的含義，在本文中，其包括分開的容器，分別包裝(即，分裝)不同的溶液。這樣，不同的溶液之間不會發生混合。其中，容器是任何能夠保存其所儲存的溶液的容器，如玻璃瓶、塑料罐等，優選是能夠長期保存其所儲存的溶液的容器。另外，優選本專利技術第二方面的試劑盒還包括記載有本專利技術第一方面所述方法的說明書。說明書可以是獨立的，如紙質說明書，其被放入試劑盒中；說明書也可以是直接印刷在試劑盒上的，如可以印刷在試劑盒中的一個或多個容器上。在第三方面，本專利技術的目的在于提供在瓊脂糖凝膠上檢測DNA的方法，其包括在瓊脂糖凝膠上進行電泳，然后進行本專利技術第一方面所述的方法。瓊脂糖凝膠電泳是本領域常規的技術，其方法步驟及使用的試劑、設備可參見《分子克隆實驗指南》(科學出版社，2002)等書籍或實驗手冊，也有許多已經商品化了。在第四方面，本專利技術的目的在于提供用于本專利技術第三方面所述方法的試劑盒，其包括分裝的瓊脂糖凝膠電泳試劑和PH為6-8的含堿性艷蘭BO的染色液。瓊脂糖凝膠電泳試劑是本領域技術人員所熟知的，其可以通過商業渠道容易地購買。所述試劑盒還可以包括分裝的醇，如40%乙醇，I %冰醋酸溶液。更優選所述試劑盒中染色液中各組分的含量如本專利技術第一方面所優選的那樣。盡管不優選，但是所述本文檔來自技高網...

【技術保護點】
在瓊脂糖凝膠上對DNA染色的方法，其特征在于，所述方法包括將瓊脂糖凝膠浸入pH為6?8的含堿性艷蘭BO的染色液中染色。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：金利泰，叢維濤，
申請(專利權)人：溫州安得森生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：