本發明專利技術公開了一種PIK3R5基因突變檢測特異性引物和液相芯片，該液相芯片主要包括有：每種由5’端的tag序列和3’端針對目的基因突變位點的特異性引物序列組成的ASPE引物，所述特異性引物序列為：針對R28C位點的SEQ?ID?NO.7及SEQ?ID?NO.8；有anti-tag序列包被的微球；擴增引物。本發明專利技術所提供的檢測液相芯片的檢測結果與測序法的吻合率高達100％，實現突變位點的野生型和突變型并行檢測。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于分子生物學領域，涉及醫學和生物技術，具體的是涉及一種PIK3R5基因突變檢測特異性引物和液相芯片。
技術介紹
磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol3-kinases, PI3K)屬于酯類的激酶(或酶)，普遍存在于體內各類細胞，能磷酸化與膜相關的磷脂酸肌醇家族，它可以募集和激活下游的靶物質而啟動一系列信號聯級反應，在細胞的有絲分裂發生、細胞存活、分化和激活、細胞骨架的構型與重塑以及囊胞的運輸起著重要的作用憐脂酸肌醇-3-激酶調節亞基5 (phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit 5)位于染色體17pl3. 1，編碼PI3K的重要組成亞基。目前，對PIK3R5基因突變進行檢測和分析的方法很少，主要有直接測序法和PCR-RFLP分析法，其中最常用的方法有PCR-RFLP分析法。PCR-RFLP法是基于基因突變造成的限制性內切酶識別位點的改變，如位點丟失或產生新位點，通過PCR擴增某一特定片段，再用限制性內切酶酶切擴增產物，電泳觀察片段的大小，這種方法用于檢測酶切位點改變的基因突變，可直接判斷基因型，但該法不能用于沒有產生新酶切位點的基因突變檢測。再次，以上這些方法都存在著檢測通量的局限性，每次只能檢測一種突變類型，不能滿足實際應用的需要。
技術實現思路
本專利技術的目的之一是提供PIK3R5基因突變檢測液相芯片，該液相芯片可用于檢測PIK3R5基因常見基因型R28C的野生型和突變型。一種PIK3R5基因突變檢測液相芯片，包括有(A).針對PIK3R5基因R28C位點的野生型和突變型的ASPE引物每種ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對目的基因突變位點的特異性引物序列組成，所述特異性引物序列為SEQID NO. 7 和 SEQ ID NO. 8 ;所述 tag 序列分別選自 SEQ ID NO.1 SEQ ID NO. 6中的不同兩種；(B).有ant1-tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球,所述ant1-tag序列與微球連接中間還設有間隔臂序列；所述ant1-tag序列選自SEQ ID NO. 9 SEQ ID NO. 14，且所述ant1-tag序列能相應地與(A)中所選的tag序列互補配對；(C).用于擴增出需要檢測的、具有R28C位點的目標序列的引物。優選地，所述擴增引物為SEQ ID NO. 15 SEQ ID NO. 16。優選地，所述ASPE引物為^SEQ ID NO.1和SEQ ID NO. 7組成的序列以及由SEQID NO. 2和SEQ ID NO. 8組成的序列。本專利技術的另一目的是提供用于PIK3R5基因突變檢測的特異性引物。具體技術方案如下用于PIK3R5基因突變檢測的特異性引物，其為SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 8。本專利技術的主要優點在于1.本專利技術所提供的檢測方法與測序法的吻合率高達100%。所制備的PIK3R5基因突變檢測液相芯片具有非常好的信號-噪聲比，并且所設計的探針以及ant1-tag序列之間基本上不存在交叉反應，tag標簽序列、ant1-tag標簽序列的選取以及tag標簽序列與具體ASPE引物的結合，能夠避免交叉反應,實現多個突變位點的并行檢測。2.本專利技術設計的ASPE引物特異性引物能夠靈敏特異地識別目標檢測的突變位點，準確區分各種型別的基因型；在同一個反應體系中，不同的特異性引物之間、特異性引物與非目標檢測的PCR擴增產物之間基本上不存在交叉反應，檢測特異性好，交叉反應率低于3% ;除了能夠檢測單個位點突變情況，也能夠同時并行檢測多個突變位點的突變情況，檢測效果一致。3.本專利技術所提供的檢測方法所需要的時間遠遠低于常用的測序技術，特別符合實際應用需要。 4.本專利技術不僅克服了傳統固相芯片敏感性不高，檢測結果的可重復性差的缺陷， 同時對現有的液相芯片技術進行改進，使得所制備微球能適用于不同的檢測項目，具有很強的拓展性。檢測的熒光信號值大大提高，從而使得檢測的靈敏度進一步得到提高，信噪比增強，檢測結果更加準確可靠。具體實施方式實施例1PIK3R5基因突變檢測液相芯片，主要包括有一、ASPE 引物針對PIK3R5基因常見基因型R28C的野生型和突變型，分別設計特異性引物序列。 ASPE引物由“tag序列+特異性引物序列”組成。ASPE引物序列如下表所示表1PIK3R5基因的ASPE引物序列中的tag序列SEQ ID NO.tag 序列(5’ -3’ )ICTTTATCAATACATACTACAATCA2CAATTCATTTACCAATTTACCAAT3CTACTATACATCTTACTATACTTT4CTTTTCAATTACTTCAAATCTTCA5ATTATTCACTTCAAACTAATCTAC6CTTTCTACATTATTCACAACATTA表2PIK3R5基因的ASPE引物序列中的特異性引物序列基因型類型特異性引物序列(5，一3’ )R28CR28C-WGCATGGACTCAGCCTCAGCC (SEQ ID NO+7)R28C-mGCATGGACTCAGCCTCAGCT (SEQ ID NO.8)每條ASPE弓I物包括兩個部分,5 ’端為針對相應微球上ant1-tag序列的特異性tag 序列，3’端為突變型或野生型特異的引物片段(如上述表I所示)。所有ASPE引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。合成后的每條引物分別用lOmmol/L Tris Buffer 配制成100pmol/mL的忙存液。二、ant1-tag序列包被的微球根據所設計的ASPE特異性引物片段，選擇tag序列，最大限度地減少各微球的 ant1-tag序列之間以及tag與ASPE特異性引物片段可能形成的二級結構，選擇的微球編號與微球上相應的ant1-tag序列如表3所示表3微球編號與微球上相應的ant1-tag序列SEQ NO.微球編號微球上對應的ant1-tag序列(5' ~3f )921TGATTGTAGTATGTATTGATAAAG1023ATTGGTAAATTGGTAAATGAATTG1131AAAGTATAGTAAGATGTATAGTAG1243TGAAGATTTGAAGTAATTGAAAAG1335GTAGATTAGTTTGAAGTGAATAAT1451TAATGTTGTGAATAATGTAGAAAG選擇的微球購自美國Luminex公司，將ant1-tag序列包被于微球上。ant1-tag 序列與微球之間連接有5-10個T的間隔臂序列，即在每個ant1-tag序列前加上一段5_10 個T的間隔臂 序列，ant1-tag序列由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。將合成的 ant1-tag序列用滅菌ddH20配成100nmol/ml的忙存液。所述間隔臂為用于將ant1-tag與微球表面間隔開來或是將ant1-tag置于親水性環境中的序列。通過在ant1-tag序列與微球之間設置適當長度的間隔臂序列，可減少空間位阻，提高雜交反應的效率以及雜交反應的特異性。常見的間隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n間隔臂(η彡3)，如(CH2)12、(本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種PIK3R5基因突變檢測液相芯片，其特征是，包括有：(A).針對PIK3R5基因R28C位點的野生型和突變型的ASPE引物：每種ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對目的基因突變位點的特異性引物序列組成，所述特異性引物序列為：SEQID?NO.7和SEQ?ID?NO.8；所述tag序列分別選自SEQ?ID?NO.1～SEQ?ID?NO.6中的不同兩種；(B).有anti?tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球，所述anti?tag序列與微球連接中間還設有間隔臂序列；所述anti?tag序列選自SEQ?ID?NO.9～SEQ?ID?NO.14，且所述anti?tag序列能相應地與(A)中所選的tag序列互補配對；(C).用于擴增出需要檢測的、具有R28C位點的目標序列的引物。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：許嘉森，甘丹翠，鄒鳳文，
申請(專利權)人：廣州益善生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：
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