本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種腫瘤用藥個(gè)體化指導(dǎo)的檢測方法，包括如下步驟：(1)采集患者樣品，并提取核酸；(2)以患者核酸為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；(3)以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)；(4)以毛細(xì)電泳的方法分離樣品。本發(fā)明專利技術(shù)一種腫瘤用藥個(gè)體化指導(dǎo)的檢測方法具有靈敏度高、重復(fù)性好、準(zhǔn)確性強(qiáng)、靈活性強(qiáng)、成本低的優(yōu)點(diǎn)。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種檢測方法，尤其是一種靈敏度高、重復(fù)性好、準(zhǔn)確性強(qiáng)、靈活性強(qiáng)、成本低的腫瘤用藥個(gè)體化指導(dǎo)的檢測方法。
技術(shù)介紹
目前經(jīng)常應(yīng)用的有實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫PCR、反轉(zhuǎn)錄PCR等，都是針對特異性靶基因進(jìn)行檢測。其中，熒光定量PCR檢測方法最為成熟。熒光定量PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是靈敏性高，并可精確定量，在對EGFR，BRAF, KRAS等的檢測中都取得了良好效果。利用特異引物對突變靶序列進(jìn)行高精準(zhǔn)PCR擴(kuò)增放大，并利用一 種新型探針在實(shí)時(shí)熒光定量PCR平臺上實(shí)現(xiàn)對樣品DNA中突變的檢測，具有很高的特異性和敏感度。其中目前在腫瘤個(gè)體化分子診斷領(lǐng)域最重要的EGFR、KRAS、BRAF三種基因突變檢測試劑產(chǎn)品已獲得SFDA《醫(yī)療器械注冊證》和歐盟CE認(rèn)證。熒光定量PCR的缺點(diǎn)通量低，一次只能檢測一個(gè)基因，如需要檢測多種相關(guān)基因突變，SNP，表達(dá)情況，就需要多臺PCR儀同時(shí)工作，效率低，周期長；成本相對較高因一次只能檢測一個(gè)基因位點(diǎn)，當(dāng)一個(gè)樣品同時(shí)需要檢測多種腫瘤相關(guān)基因時(shí)，必須一個(gè)一個(gè)檢測，成本相對增高；不適用于檢測固定包埋后的病理組織，但患者可供的多數(shù)是固定后的組織；只能設(shè)定一個(gè)內(nèi)參基因(管家基因)，但腫瘤組織的管家基因有別于正常組織，需要一組管家基因作內(nèi)參；只能同步檢測最多三種基因，但個(gè)體化治療需要同步檢測十幾種甚至更多的基因。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種靈敏度高、重復(fù)性好、準(zhǔn)確性強(qiáng)、靈活性強(qiáng)、成本低的腫瘤用藥個(gè)體化指導(dǎo)的檢測方法。本專利技術(shù)采用如下技術(shù)方案，包括如下步驟(I)采集患者樣品，并提取核酸；(2)以患者核酸為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；(3)以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)；(4)以毛細(xì)電泳的方法分離樣品。優(yōu)選地，所述步驟(I)中的患者樣品包括新鮮、冰凍腫瘤組織等等。優(yōu)選地，所述步驟(2)包括按比例在樣品板上加入試劑和樣品、以及混勻后在一定溫度下孵育的子步驟。優(yōu)選地，所述步驟(2)中的孵育溫度分別為48°C、42°C、95°C、4°C。優(yōu)選地，所述步驟(3)包括按比例在樣品板上加入試劑和樣品、以及混勻后按一定溫度進(jìn)行熱循環(huán)反應(yīng)的子步驟。優(yōu)選地，所述步驟(3)的子步驟中的熱循環(huán)溫度分別為95°C、94°C、55°C、70°C、4。。。本專利技術(shù)的有益效果為1.靈敏度高、重復(fù)性好采用激光誘導(dǎo)熒光-PMT，具有超高靈敏度。2.準(zhǔn)確性強(qiáng)采用毛細(xì)管電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離檢測，可將非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物、引物二聚體和特異性擴(kuò)增產(chǎn)物分離，最大程度降低假陽性。3.高通量本系統(tǒng)采用雙(96孔)板、自動(dòng)加樣和樣品追蹤技術(shù)，實(shí)現(xiàn)單個(gè)反應(yīng)檢測30-40個(gè)位點(diǎn)，可同時(shí)做192個(gè)反應(yīng)(如192個(gè)患者樣品，每個(gè)樣品檢測11個(gè)相關(guān)基因)，本方法可一次性給出準(zhǔn)確報(bào)告，避免漏檢。4.精確定量可精確定量基因突變，SNP，表達(dá)拷貝數(shù)。5.靈活性強(qiáng)可隨時(shí)根據(jù)需求調(diào)整檢測的靶基因，例如新發(fā)現(xiàn)的靶向位點(diǎn)，可立即設(shè)計(jì)特異性引物，將其放入“腫瘤個(gè)體化治療用藥指導(dǎo)多重基因檢測方案”中去。 6.成本低每個(gè)樣品的檢測成本少于Y50,利于大規(guī)模推廣。具體實(shí)施例方式下面根據(jù)實(shí)施例對本專利技術(shù)作進(jìn)一步詳細(xì)說明。本專利技術(shù)創(chuàng)立了一種同步檢測11種常見腫瘤個(gè)體化治療相關(guān)基因的多重基因檢測方案。檢測步驟采集患者樣品(新鮮，冰凍組織等)，提取核酸，以患者核酸為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)，最終用毛細(xì)電泳方法分離樣品。1.檢測的基因及內(nèi)容包括(表I)。2.建立了可靠地樣品質(zhì)量及反應(yīng)過程的對照(表I)a)人RNA完整性的對照內(nèi)參確保在檢驗(yàn)過程中對樣品質(zhì)量的判斷，避免假陰性。b)正常反應(yīng)對照內(nèi)參監(jiān)控PCR反應(yīng)效率，避免假陰性。表1:權(quán)利要求1.，包括如下步驟 (1)采集患者樣品，并提取核酸； (2)以患者核酸為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄； (3)以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)； (4)以毛細(xì)電泳的方法分離樣品。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的，所述步驟(I)中的患者樣品包括新鮮、冰凍腫瘤組織。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的，所述步驟(2)包括按比例在樣品板上加入試劑和樣品、以及混勻后在一定溫度下孵育的子步驟。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的，所述步驟(2)中的孵育溫度分別為 48 °C、42 °C、95 °C、4°C。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的，所述步驟(3)包括按比例在樣品板上加入試劑和樣品、以及混勻后按一定溫度進(jìn)行熱循環(huán)反應(yīng)的子步驟。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的，所述步驟(3)的子步驟中的熱循環(huán)溫度分別為95°C、94°C、55°C、70°C、4°C。全文摘要本專利技術(shù)公開了，包括如下步驟(1)采集患者樣品，并提取核酸；(2)以患者核酸為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；(3)以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)；(4)以毛細(xì)電泳的方法分離樣品。本專利技術(shù)具有靈敏度高、重復(fù)性好、準(zhǔn)確性強(qiáng)、靈活性強(qiáng)、成本低的優(yōu)點(diǎn)。文檔編號C12Q1/68GK102994627SQ20121020658公開日2013年3月27日 申請日期2012年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月21日專利技術(shù)者吳勇, 李令棟, 南麗, 顏進(jìn), 王晴晴 申請人:海爾施生物醫(yī)藥股份有限公司本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種腫瘤用藥個(gè)體化指導(dǎo)的檢測方法，包括如下步驟：(1)采集患者樣品，并提取核酸；(2)以患者核酸為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；(3)以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)；(4)以毛細(xì)電泳的方法分離樣品。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：吳勇，李令棟，南麗，顏進(jìn)，王晴晴，
申請(專利權(quán))人：海爾施生物醫(yī)藥股份有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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