本發明專利技術涉及一種利用透性化細胞β-半乳糖苷酶制備低聚半乳糖的方法，向乳糖溶液中加入透性化細胞β-半乳糖苷酶，乳糖溶液濃度為100~500g/L，透性化細胞β-半乳糖苷酶加入量為200~1500mg/g乳糖，30~45℃，反應2~15h后，離心分離，得到的上清液即為低聚半乳糖溶液。利用透性化細胞β-半乳糖苷酶制備低聚半乳糖，避免了胞內酶的提取純化過程，簡化了工藝操作，降低了生產成本。采用無水乙醇處理乳酸克魯維酵母制備透性化細胞，未引入氯仿等具有毒性的化學試劑，無食品安全問題，可廣泛應用于食品行業。并可多次重復利用，可顯著降低低聚半乳糖的生產成本。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種低聚半乳糖的制備方法，特別是一種利用透性化細胞β -半乳糖苷酶制備低聚半乳糖的方法，屬于酶制劑制備與功能性低聚糖生產領域。
技術介紹
隨著公眾飲食結構的變化，具有調節生理活性功能的食品——功能性食品需求量增大，其中功能性低聚糖尤其受到人們的青睞。我國于2007年啟動了 “國家公眾營養改善OLIGO (低聚糖)項目”，使功能性低聚糖的市場需求大幅增加。其中，低聚半乳糖因具有水溶性好、粘度低，對熱和酸穩定等優點，可用于提高食品色澤、風味、質地以及延長貨架期； 同時，低聚半乳糖還可增殖腸道內的雙歧桿菌，改善人體腸道菌群分布與脂質代謝，并可促進鈣、維生素吸收，提高人體免疫力，因此開發低成本制備低聚半乳糖的技術方法具有重要意義。目前，低聚半乳糖多以乳糖為底物，利用β-半乳糖苷酶的催化活性將乳糖水解生成的半乳糖基轉移至乳糖上而制得，其中β-半乳糖苷酶的提取純化是制約低聚半乳糖工業化生產的關鍵。β -半乳糖苷酶廣泛存在于動、植物和微生物中，已報道的產酶微生物包括細菌、霉菌和酵母菌等，其中酵母菌產酶的最適PH為中性，適于牛乳水解及治療乳糖不耐癥；但由于乳酸克魯維酵母產生的半乳糖苷酶為胞內酶，使得提取純化過程復雜、且難度大、效率低，因此利用游離β-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的工藝成本較高。細胞膜具有選擇透過性，采用透性化技術處理細胞，可改變其通透性，同時保持細胞整體結構完整，并可保證胞內酶仍具有催化活性。滲透處理方法包括物理法(如滲透壓法、反復凍融法、熱休克法和超聲細胞破碎法)、化學法(如表面活性劑法、有機溶劑法和螯合劑法)以及生物化學法(如抗生素法和酶法)等。專利CN 1225389Α利用無水乙醇和氯仿，經過冷凍干燥處理得到透性化乳酸克魯維酵母細胞β -半乳糖苷酶，但制備過程中因使用氯仿，使產品不能直接用于食品行業。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種利用透性化細胞β -半乳糖苷酶，操作簡便且低成本的制備低聚半乳糖的方法。本專利技術的另一目的是提供一種無毒性的透性化細胞β -半乳糖苷酶的制備方法，該透性化細胞半乳糖苷酶是由乳酸克魯維酵母經細胞滲透處理技術而獲得，能夠以乳糖為底物催化合成低聚半乳糖。為了實現上述目的，本專利技術所選產半乳糖苷酶的菌株為乳酸克魯維酵母，購自中國工業微生物菌種保藏管理中心(北京)，菌種名稱乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis), CICC 編號1773。本專利技術的技術方案如下一種利用透性化細胞β_半乳糖苷酶制備低聚半乳糖的方法，其特征在于，向乳糖溶液中加入透性化細胞β -半乳糖苷酶，乳糖溶液濃度為10(T500g/L，透性化細胞β -半乳糖苷酶加入量為20(Tl500mg/g乳糖，30^450C，反應2 15h后，離心分離，得到的上清液即為低聚半乳糖溶液。本專利技術所述透性化細胞β -半乳糖苷酶的制備方法為由乳酸克魯維酵母經細胞滲透處理技術獲得，所用乳酸克魯維酵母購自中國工業微生物菌種保藏管理中心，菌種名稱乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)，CICC 編號1773。上述細胞滲透處理技術為向每克乳酸克魯維酵母細胞中加入5(T200mL的PBS緩沖液(50mmol/LpH 8. ONaH2PO4-Na2HPO4)制得懸浮細胞；再向其中加入無水乙醇，無水乙醇與懸浮細胞的體積比為2:5 1:1，于25°C下振蕩fl5min，離心后棄去上清液，所得沉淀經PBS緩沖液洗滌兩次后即得透性化細胞β -半乳糖苷酶。上述乳酸克魯維酵母的發酵條件為溫度28 30°C，搖床轉速10(T250rpm，接種量5 10% (v/v)，在液體培養基中培養8tT30h。 上述乳酸克魯維酵母發酵所用液體培養基組成與配制方法為酵母膏3. 0g，麥芽浸膏3. 0g，蛋白胨5. 0g，乳糖20. 0g，蒸餾水1. 0L, pH 7. 0,121°C高壓滅菌20min。本專利技術利用透性化乳酸克魯維酵母細胞β -半乳糖苷酶制備低聚半乳糖，其有益效果在于(I)利用透性化細胞半乳糖苷酶制備低聚半乳糖，避免了胞內酶的提取純化過程，簡化了工藝操作，降低了生產成本。(2)透性化細胞中β -半乳糖苷酶所處環境仍為胞內環境，使其表現出比游離酶更高的催化合成低聚半乳糖的活性，更有利于發揮其催化功能。(3)本專利技術采用無水乙醇處理乳酸克魯維酵母制備透性化細胞，未引入氯仿等具有毒性的化學試劑，無食品安全問題，可廣泛應用于食品行業。(4)透性化細胞中β -半乳糖苷酶類似囊化固定化酶形式，易于從反應體系中分離回收，并可多次重復利用，可顯著降低低聚半乳糖的生產成本。附圖說明圖1透性化細胞β -半乳糖苷酶制備低聚半乳糖色譜分析圖；圖2 (a)透性化細胞β -半乳糖苷酶最適pH曲線圖；圖2 (b)透性化細胞β -半乳糖苷酶最適溫度曲線圖；圖3乳酸克魯維酵母發酵時間對產β -半乳糖苷酶酶活的影響曲線圖。具體實施例方式下面結合實施例，對本專利技術的技術方案做進一步闡述，但本專利技術所保護范圍不僅限于實施例。實施例中所用的無水乙醇、蛋白胨、酵母膏、麥芽糖等均為市售產品。乳酸克魯維酵母，購自中國工業微生物菌種保藏管理中心(北京)，菌種名稱乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis), CICC 編號1773。實施例中低聚半乳糖的含量及收率采用高效液相色譜檢測計算而得，色譜條件為示差檢測器，Aminex ΗΡΧ-87Η色譜柱，流動相為O. 05Μ H2SO4,流速O. 6mL/min,柱溫65°C，進樣量20 μ L。低聚半乳糖的含量通過標準糖樣品(葡萄糖、半乳糖、乳糖)的標準曲線計算得到。低聚半乳糖收率=低聚半乳糖實際生成量/低聚半乳糖理論生成量X 100%。以乳糖為底物，采用透性化細胞β-半乳糖苷酶催化乳糖制備的低聚半乳糖溶液經高效液相色譜檢測分析，包含有葡萄糖、半乳糖、轉移二糖、低聚半乳糖以及部分未被分解的乳糖，各組分的保留時間及出峰順序如圖1所示。實施例1:乳酸克魯維酵母透性化細胞的制備對乳酸克魯維酵母進行發酵實驗，培養基組成為酵母膏3.0g，麥芽浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，乳糖20.0g，蒸餾水L0L，pH 7.0，121°C高壓滅菌20min。發酵條件為28°C，搖床轉速lOOrpm，接種量5%(v/v)，培養8h，所得乳酸克魯維酵母發酵液的酶活約為1. OOU/mL。將發酵液在5000rpm、4°C下離心5min，沉淀經水洗后加入PBS緩沖液稀釋至50g/L，制得懸浮細胞。按無水乙醇與懸浮細胞稀釋液體積比為2:5加入無水乙醇,251€下震蕩處理lmin。在5000rpm、4°C下離心5min后,沉淀用PBS緩沖液洗滌兩次，棄去上清液，取沉淀即可得到透性化細胞β -半乳糖苷酶，并用PBS緩沖液稀釋至20g/L。透性化細胞β-半乳糖苷酶制備低聚半乳糖取100mL100g/L乳糖溶液，按透性化細胞加入量為(200mg/g乳糖)加入100mL20g/L的透性化細胞溶液，在30° C、160rpm的水浴搖床中反應2h，取100 μ L酶解液稀釋20倍，在12000rpm下離心2min，上清液過0. 45 μ m水膜后進高效液相色譜檢測，得到低聚半乳糖含量為10g/L，收率為10%。實施例2 乳酸克魯維酵母透性化細本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種利用透性化細胞β?半乳糖苷酶制備低聚半乳糖的方法，其特征在于，向乳糖溶液中加入透性化細胞β?半乳糖苷酶，乳糖溶液濃度為100~500g/L，透性化細胞β?半乳糖苷酶加入量為200~1500mg/g乳糖，30~50℃，反應2~15h后，經離心分離得到的上清液即為低聚半乳糖溶液。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：齊崴，王夢凡，何志敏，張帥帥，邢肖肖，蘇榮欣，
申請(專利權)人：天津大學，
類型：發明
國別省市：
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