本發明專利技術提供一種牛蒡苷元在制備調節PP2A活性的試劑中的應用。牛蒡苷元在制備調節PP2A活性試劑的應用中，還可以具有這樣的特征：其中，牛蒡苷元的加入量為1～10μm，PP2A的活性在此范圍內隨著牛蒡苷元的加入量的增加而提高。ATG作為一個能高度結合PP2A且能影響其活性的天然小分子化合物，具有良好的應用前景。
【技術實現步驟摘要】
【專利摘要】本專利技術提供一種牛蒡苷元在制備調節PP2A活性的試劑中的應用。牛蒡苷元在制備調節PP2A活性試劑的應用中，還可以具有這樣的特征：其中，牛蒡苷元的加入量為1～10μm，PP2A的活性在此范圍內隨著牛蒡苷元的加入量的增加而提高。ATG作為一個能高度結合PP2A且能影響其活性的天然小分子化合物，具有良好的應用前景。【專利說明】牛蒡苷元在調節PP2A活性中的應用
本專利技術涉及一種牛蒡苷元在調節PP2A活性中的應用，屬于中醫藥領域。
技術介紹
牛蒡苷元(ATG)是中藥牛蒡子中的主要單體化合物。牛蒡子被臨床廣泛用于糖尿 病的治療，但其作用機制和有效作用成分還不明確。本次研究發現ATG有明顯的減少糖尿病 小鼠蛋白尿的作用。 PP2A是絲氨酸蘇氨酸磷酸化酶，調節真核細胞中大部分的磷酸化酶。在信號轉導 的級聯反應中與其他磷酸化酶和激酶相互作用，構成調節大分子調控下游信號的轉導。在 糖尿病腎臟疾病(DKD)中P65是導致炎癥反應的關鍵通路。PP2A可以通過去磷酸化P65,來發 揮治療DKD的作用。此外，目前有研究揭示PP2A與原癌基因 c-Myc之間有著密切的聯系。PP2A 調節亞基Β56α選擇性地與C-Myc的N端結合，引起c-Myc表達水平顯著降低。利用shRNA解除 Β56α與c-Myc的結合，可導致c-Myc過度表達、c-Myc Ser62磷酸化水平的提高及c-Myc功能 的增強等現象，依此很容易聯想到PP2A在細胞增殖分化調控中擔當著某種關鍵的角色。ATG 與PP2A活性之間的關系在之前的研究中并未闡明。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種ATG在調節PP2A活性中的應用，是ATG的一種新應用。 本專利技術采用了如下技術方案：本專利技術首先提供一種ATG在制備調節PP2A活性的試劑中的應用。進一步，在ATG制備成調節PP2A活性試劑的應用中，還可以具有這樣的特征:其中， ATG的加入量為1~10μπι，ΡΡ2Α的活性在此范圍內隨著牛蒡苷元的加入量的增加而提高。 本專利技術還提供一種提高293Τ細胞中ΡΡ2Α活性的方法，其特征在于:包括加入ATG的 步驟。 進一步，本專利技術的提高293Τ細胞中ΡΡ2Α活性的方法，還可以具有這樣的特征：其 中，ATG的加入量是ΙμΜ~ΙΟμΜ。 本專利技術還提供一種ATG在回收ΡΡ2Α蛋白中的應用，其特征在于，包括如下步驟： 步驟一，加入100μΜ~ΙΟΟΟμΜ的ATG刺激細胞。步驟二，提取細胞并粉碎； 步驟三，上樣并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳； 步驟四，切下與ΡΡ2Α分子量相對應部分的凝膠條帶，回收蛋白。進一步，本專利技術的ATG在回收ΡΡ2Α蛋白中的應用，還可以具有這樣的特征:其中，回 收蛋白時，將凝膠條帶用碾磨棒碾碎，在其中加入小于500μ1/塊膠的緩沖液，在4攝氏度靜 置10小時，然后5000-10000rpm離心10min，上清液中即含有ΡΡ2Α蛋白。專利技術的有益效果 本專利技術的ATG在調節PP2A活性中的應用，提供了 ATG在調節PP2A活性中的新用途， ATG作為一個能高度結合PP2A且能影響其活性的天然小分子化合物，具有良好的應用前景。【附圖說明】 圖1是DARTS-western雜交的結果圖。圖2是不同濃度的ATG刺激后的PP2A活性圖。【具體實施方式】以下結合【具體實施方式】詳細說明本專利技術的技術方案。 1、ATG刺激293T的質譜分析使用 2 9 3 T細胞，用M-PER mammalian protein extraction buffer (785〇lThermoFisher)和磷酸酶抑制劑（5〇mM NaF, ΙΟηιΜβ-glycerophosphate，5mM sodium pyrophosphate，2mM Na3V04)消化297T細胞。在細胞裂解液中加入1 OX TNC緩沖液（500mM Tris-HCl pH 8.0,500mM NaCl，100mM CaC12)并用bradford法（500-0006Bi〇-rad)測量蛋 白質濃度。在細胞裂解液中加或不加 ATG，加 ATG時嘗試膻300μΜ，一起放在室溫下培養lh。隨 后在細胞裂解液放入不同濃度的鏈霉蛋白酶at 1:1000(10165921001, Roche)室溫下放置 20分鐘裂解蛋白質。兩組裂解液行質譜檢測比較差異，結果見圖1。圖1:ATG干預后質譜比較結果 分析質譜結果顯示，結合最多的2個蛋白是微管蛋白，由于本身細胞內微管蛋白的 含量很高，所以我們認為是非特異性的。且由于正常狀態下PP2A在細胞中的含量很低，所以 我們認為ATG和PP2A的結合率很高。 2、ATG與PP2A結合的western blot實驗。 ATG刺激293T細胞。選擇鏈霉蛋白酶最佳濃度為1:1000后，我們選擇了不同濃度的 ATG刺激293T細胞，來觀察ATG與PP2A的結合量能否隨著ATG濃度的增高而加大。根據ATG的 刺激濃度不同分為3組:01^0、10(^]\1，30(^]\1、100(^]\1。加入鏈霉蛋白酶的濃度為1 :1000。故 Western Blot-共分5組:空白組(未加鏈霉蛋白酶）、DMS0(鏈霉蛋白酶1:1000)、ATG100yM (鏈霉蛋白酶1:1000)、ATG300yM(鏈霉蛋白酶1:1000)、ATG1000yM(鏈霉蛋白酶1:1000)。結 果發現在鏈霉蛋白酶1:1000的條件(鏈霉蛋白酶可以消化蛋白，但是它消化未與ATG結合的 蛋白比消化已經與ATG結合的蛋白多。我們測試了不同濃度的鏈霉蛋白酶，結果發現1:1000 的濃度能夠幫助我們很好的發現與ATG結合和不與ATG結合蛋白的差異，這種用來研究小分 子化合物的結合蛋白的方法叫DARTS】。可以發現隨著ATG濃度的增加，PP2A結合也隨之增 加，結果見圖2。 圖2:DARTS-western blot證實ATG與PP2AB結合，PP2A有3個結構單元，ATG結合的 是催化劑單元。這個催化劑單元的蛋白叫PP2AB，基因叫PPP2CB。如果需要提取PP2A蛋白，則不加鏈霉蛋白酶，采用如下步驟： 步驟一，加入100μΜ~ΙΟΟΟμΜ的ATG刺激細胞。步驟二，提取細胞并粉碎；步驟三，上樣并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳；步驟四，切下與PP2A分子量相對應部分的凝膠條帶，回收蛋白。回收蛋白時，將凝 膠條帶用碾磨棒碾碎，在其中加入小于500μ1/塊膠的緩沖液，在4攝氏度靜置10小時，然后 5000-10000rpm離心10min，上清液中即含有ΡΡ2Α蛋白。采用此種方法的蛋白回收率是70%。 步驟中的細胞可以是293T細胞，也可以是其它種類的細胞。 3、ATG對PP2A活性的影響 用濃度分別為0、1. Ομπι、3.3μπι、ΙΟμπι的ATG刺激293T細胞，刺激時間為1小時，利用 ΡΡ2Α活性試劑盒（R&D systems，DYC3309-2)檢測ΡΡ2Α活性，結果發現隨著ATG濃度增加， PP2A的活性也隨之增加，結果見表1和圖3。可見ATG能有效增加 PP2A的活性。隨著ATG用量的 增加，PP2A的活性也隨之增加。 表1:PP2A活性值 注:P值是與DMS0比較。【主權項】1. 牛蒡苷元在制備調節PP2A活性的試劑中的本文檔來自技高網...
【技術保護點】
牛蒡苷元在制備調節PP2A活性的試劑中的應用。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：鐘逸斐，
申請(專利權)人：上海中醫藥大學附屬龍華醫院，
類型：發明
國別省市：上海;31
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