一種細(xì)菌纖維素連續(xù)增厚的培養(yǎng)方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種細(xì)菌纖維素連續(xù)增厚的培養(yǎng)方法，在細(xì)菌纖維素靜置培養(yǎng)過程中，通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)容器的密閉空間和透氧材料下方的空氣壓力與氧氣體積濃度，并在所述密閉空間的內(nèi)部上方均勻噴淋發(fā)酵培養(yǎng)液，實(shí)現(xiàn)細(xì)菌纖維素厚度的連續(xù)增長，明顯提高纖維素的產(chǎn)率，制備過程簡便，綠色環(huán)保，并能夠降低規(guī)模化生產(chǎn)時(shí)的成本。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一種細(xì)菌纖維素的培養(yǎng)方法，特別是涉及。
技術(shù)介紹
對(duì)于纖維素生物合成的研究有著諸多報(bào)道，其中通過革蘭氏陰性，原核細(xì)胞類的木醋桿菌生物合成得到的纖維素具有產(chǎn)率高、純度高的優(yōu)點(diǎn)而被選為細(xì)菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)的模板菌種。木醋桿菌生物合成纖維素的過程可以分為細(xì)胞內(nèi)小分子聚合形成β-1，4-葡萄糖大分子鏈與細(xì)胞外微纖絲逐步、層次化“自組裝”形成纖維素network網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)兩個(gè)過程。細(xì)菌纖維素獨(dú)特的生物合成過程使其在內(nèi)部結(jié)構(gòu)上具有“層次化”的特點(diǎn)首先，纖維素絲束(斷面直徑600nm Ιμπι)中的晶區(qū)微纖絲(斷面直徑7nm)之間的縫隙相當(dāng)于一根根極細(xì)的毛細(xì)管，能夠源源不斷地將親水小分子吸入細(xì)菌纖維素內(nèi)部，在晶區(qū)之間形成無定型區(qū)。這賦予了細(xì)菌纖維素超強(qiáng)的吸濕能力，能夠吸收自重700倍甚至更多的水分；其次，由剛性的β -1, 4-葡萄糖大分子鏈通過分子內(nèi)與分子間氫鍵結(jié)晶形成的微纖絲使細(xì)菌纖維素具有良好的力學(xué)強(qiáng)度。通過堿液與絲束內(nèi)部無定型區(qū)的水在高濃度向低濃度滲透作用下，使微纖絲分子內(nèi)分子間氫鍵的重排，再經(jīng)過熱壓干燥處理，使得絲束內(nèi)部的晶區(qū)增大，微纖絲之間氫鍵結(jié)合位點(diǎn)明顯增加，能夠大大提高BC薄膜的力學(xué)強(qiáng)度，楊氏模量最高可達(dá)15GPa ;第三，木醋桿菌具有極強(qiáng)的氧氣依賴特性，纖維素network結(jié)構(gòu)形成于氧氣與培養(yǎng)液氣液兩相界面處。利用這種生物特性，能夠通過靜置培養(yǎng)得到一系列不同形狀的細(xì)菌纖維素材料。這三大結(jié)構(gòu)上的特征，使細(xì)菌纖維素能夠作為基材制成傷口敷料、造紙、聲學(xué)振膜、透明材料等產(chǎn)品，在生物醫(yī) 學(xué)、食品、半導(dǎo)體、日用品等多個(gè)領(lǐng)域獲得廣泛的應(yīng)用。但是，細(xì)菌纖維素在靜置培養(yǎng)階段的產(chǎn)率較低，規(guī)模化制備成本高昂是目前細(xì)菌纖維素產(chǎn)業(yè)化面臨的主要瓶頸。關(guān)于提高細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的研究，至今已取得了許多成果。日本科學(xué)家提出“兩步法”高效制備椰果產(chǎn)品通過前期動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，使細(xì)菌細(xì)胞體積濃度在短時(shí)間內(nèi)上升兩個(gè)數(shù)量級(jí)，隨后將高密度的菌液轉(zhuǎn)接入淺盤進(jìn)行靜置培養(yǎng)，大大縮短了培養(yǎng)周期，同時(shí)得到的椰果果片表面平整，脫水收縮的現(xiàn)象也大有改善。研究人員受此啟發(fā)，設(shè)計(jì)了例如氣升式、轉(zhuǎn)鼓式、轉(zhuǎn)盤式等一系列動(dòng)態(tài)培養(yǎng)裝置來培養(yǎng)細(xì)菌纖維素。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，現(xiàn)有細(xì)菌纖維素動(dòng)態(tài)培養(yǎng)得到的產(chǎn)量能夠達(dá)到12.6g/7天。動(dòng)態(tài)培養(yǎng)的方式在產(chǎn)量上能夠彌補(bǔ)靜態(tài)培養(yǎng)的不足，但是所得到的細(xì)菌纖維素外形多為絮狀、團(tuán)簇狀、球形、星形等形狀，直接利用價(jià)值較低。此外，通過轉(zhuǎn)盤式發(fā)酵罐得到的細(xì)菌纖維素均質(zhì)性 (Homogeneity)較差,培養(yǎng)后期隨著細(xì)菌纖維素膜厚度增加，會(huì)從轉(zhuǎn)盤上脫落，培養(yǎng)液中的絲絮狀纖維素會(huì)纏繞在轉(zhuǎn)動(dòng)軸上，使機(jī)器無法轉(zhuǎn)動(dòng)。從根本上說，“兩步法”依然屬于靜態(tài)培養(yǎng)范疇，提高的只是單批次細(xì)菌纖維素膜的產(chǎn)量，批次與批次之間存在著較長的“零產(chǎn)量”時(shí)間(也稱為“Dead time”)。由于發(fā)酵培養(yǎng)液上方空氣對(duì)于細(xì)菌纖維素內(nèi)部network結(jié)構(gòu)的擴(kuò)散作用，使得細(xì)菌纖維素內(nèi)部存在著有氧區(qū)(aerobiczone),該區(qū)域很小,厚度不超過Imm,但是80%的纖維素是由處于有氧區(qū)內(nèi)部的細(xì)菌所生物合成的。細(xì)菌纖維素膜下方的培養(yǎng)液在“毛細(xì)作用”趨勢(shì)，不斷被吸入細(xì)菌纖維素內(nèi)部，形成“碳源區(qū)”。“有氧區(qū)”與“碳源區(qū)”產(chǎn)生重疊，則細(xì)菌纖維素得以連續(xù)形成。 隨著細(xì)菌纖維素膜的厚度增加，下方培養(yǎng)液不足以向上滲透至靠近上表面的“有氧區(qū)”，宏觀上體現(xiàn)為纖維素產(chǎn)量逐漸下降并最終停止生長。因此，如何有效的延長“有氧區(qū)”與“碳源區(qū)”產(chǎn)生重疊的時(shí)間，是細(xì)菌纖維素連續(xù)生產(chǎn)的關(guān)鍵。本專利技術(shù)通過調(diào)節(jié)與細(xì)菌纖維素上表面和下表面相接觸的空氣壓力與氧氣體積濃度，同時(shí)在培養(yǎng)過程中向細(xì)菌纖維素上表面噴淋發(fā)酵培養(yǎng)液，在細(xì)菌纖維素的上表面和下表面分別形成“有氧區(qū)”與“碳源區(qū)”的重疊，并延長有效重疊的時(shí)間，實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌纖維素連續(xù)增厚培養(yǎng)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)涉及。在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過增加與細(xì)菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力，增強(qiáng)氣體對(duì)細(xì)菌纖維素膜的擴(kuò)散作用，使細(xì)菌纖維素內(nèi)部靠近上表面的有氧區(qū)增大；同時(shí)在容器底部采用透氧材料向細(xì)菌纖維素下表面進(jìn)行供氧，氧氣滲透通過透氧材料與細(xì)菌纖維素下表面相接觸并產(chǎn)生擴(kuò)散，使細(xì)菌纖維素下表面也存在“有氧區(qū)”。本專利技術(shù)通過雙面供氧的方式，將細(xì)菌纖維素內(nèi)部“有氧區(qū)”提高至現(xiàn)有公開技術(shù)的兩倍以上，能夠明顯提高纖維素的產(chǎn)率。作為優(yōu)選的技術(shù)方案如上所述的，所述的細(xì)菌纖維素是由木醋桿菌在靜置培養(yǎng)條件下，與細(xì)胞內(nèi)通過在酶的催化作用下，將小分子葡萄糖以β -1, 4-糖苷鍵相互鍵合，聚合形成β -1, 4-葡萄糖大分子鏈，由細(xì)胞體側(cè)面的“終端合成物(Terminal complex)”擠出細(xì)胞體外。β -1, 4-葡萄糖大分子鏈在分子內(nèi)與分子間氫鍵作用下，聚集并結(jié)晶形成纖維素微纖絲(纖維素微晶，斷面直徑約7nm)，微纖絲進(jìn)一步形成絲帶(Ribbon， 斷面直徑約125nm)、絲束(Bundle,斷面直徑約600nm Ιμπι)。在細(xì)菌細(xì)胞無規(guī)則折線形運(yùn)動(dòng)與細(xì)胞分裂兩種現(xiàn)象同時(shí)存在的情況下，纖維素絲束交織形成纖維素network網(wǎng)狀結(jié)·構(gòu)，最終形成細(xì)菌纖維素。本專利技術(shù)還提供，包括以下步驟I)發(fā)酵培養(yǎng)液的調(diào)配；發(fā)酵培養(yǎng)液組分，以質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)，單位為wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇2 5，蛋白胨O. 05、. 5，酵母膏O. 05、. 5，檸檬酸O. θΓθ. 1，磷酸氫二鈉0. 02、. 2，磷酸二氫鉀 ο. οΓο. 1，余量為水；發(fā)酵培養(yǎng)液的pH為4. O 6. O ;將上述組分混合后經(jīng)高壓蒸汽滅菌后紫外輻照并冷卻至室溫，通純氧，即得發(fā)酵培養(yǎng)液；2)菌種擴(kuò)培；將所述的發(fā)酵培養(yǎng)液接種和擴(kuò)培；擴(kuò)培程度菌種細(xì)胞數(shù)目在2X105 2X107個(gè) /ml。3)靜置培養(yǎng)；將擴(kuò)培后的菌液轉(zhuǎn)移至裝有發(fā)酵培養(yǎng)液的培養(yǎng)容器中，液面高度不宜超過5cm，放置于恒溫培養(yǎng)環(huán)境內(nèi)，28 32°C靜置培養(yǎng)；通過在培養(yǎng)過程中調(diào)節(jié)與細(xì)菌纖維素上表面相接觸的空氣壓力與氧氣體積濃度以及與培養(yǎng)容器底部透氧材料下表面相接觸的空氣壓力與氧氣體積濃度，結(jié)合在靜置培養(yǎng)過程中向細(xì)菌纖維素上表面均勻噴淋調(diào)配好的發(fā)酵培養(yǎng)液來實(shí)現(xiàn)細(xì)菌纖維素的厚度連續(xù)增長；所述的連續(xù)增長分為三個(gè)階段a.細(xì)菌纖維素生長誘導(dǎo)期控制與細(xì)菌纖維素上表面相接觸的空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓,與培養(yǎng)容器底部透氧材料下表面相接觸的空氣壓力在上限不超過1.1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，下限高于I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓范圍內(nèi)，同時(shí)保持空氣流通，直至細(xì)菌將培養(yǎng)液中溶解的氧氣消耗殆盡，培養(yǎng)液上表面與透氧材料上表面均出現(xiàn)一層半透明的細(xì)菌纖維素薄膜；b.細(xì)菌纖維素快速增長期控制與培養(yǎng)液液面上方細(xì)菌纖維素薄膜上表面相接觸的空氣壓力為I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，氧氣體積濃度為10 15% ;控制與培養(yǎng)容器底部透氧材料下表面相接觸的空氣壓力在上限不超過1. 2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，下限高于I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓范圍內(nèi)，氧氣體積濃度為10 15%。直至培養(yǎng)液上表面與透氧材料上表面的細(xì)菌纖維素薄膜厚度達(dá)到O. 5 1. 5mm ;c.細(xì)菌纖維素平穩(wěn)增長期平穩(wěn)生長期分為兩個(gè)階段第一階段維持與培養(yǎng)液液面上方細(xì)菌纖維素薄膜上表面相接觸空氣壓力在上限不超過1. 2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下限高于I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓范圍內(nèi)，氧氣體積濃度為10 15% ;控制與培養(yǎng)容器底部透氧材料下表面相接觸的本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種細(xì)菌纖維素連續(xù)增厚的培養(yǎng)方法，其特征是：在細(xì)菌纖維素靜置培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)容器為上部是密閉空間且底部是透氧材料的容器；調(diào)節(jié)所述培養(yǎng)容器的密閉空間和透氧材料下方的空氣壓力與氧氣體積濃度，并在所述密閉空間的內(nèi)部上方均勻噴淋發(fā)酵培養(yǎng)液，實(shí)現(xiàn)細(xì)菌纖維素厚度的連續(xù)增長。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王華平，楊敬軒，李喆，陳仕艷，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：東華大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：