一種釀酒酵母及其應用制造技術

本發明專利技術公開了一種釀酒酵母（Saccharomyces?cerevisiae）及其應用，該釀酒酵母的保藏編號為CCTCC?No：M2012215，經發酵培養后谷胱甘肽產量高，有效解決微生物中酵母合成產率低及谷胱甘肽干酵母中谷胱甘肽含量低的問題，拓寬富含谷胱甘肽干酵母的應用范圍，提高了產品附加價值。

【技術實現步驟摘要】
一種釀酒酵母及其應用
本專利技術屬于微生物
，具體而言，涉及一株合成谷胱甘肽能力較強的釀酒酵母 i^acclmromyces cerevisiae)及其應用。
技術介紹
谷胱甘肽，gp Y-L-谷氨酰-L-半胱氨酰甘氨酸，是微生物細胞內最豐富的非蛋白巰基化合物，由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸經肽鍵縮合而成，同時具有Y -谷氨酰基和巰基。GSH廣泛存在于自然界的生物體中。在生物體內，GSH有著多種重要的生理功能， 主要為三個方面，如抗氧化、增強免疫和解毒。第一，對于維持生物體內適宜的氧化還原環境，GSH起著至關重要的作用。第二，增強免疫，在高等真核細胞中，GSH可以迅速增強機體的免疫力。第三，作為解毒劑，GSH長被用于與其它物質組合構成治療或保健藥物。近年來， 日本科學家發現GSH具有抑制艾滋病病毒的功效。谷胱甘肽在醫學、食品、化妝品等領域具有廣泛的市場前景。谷胱甘肽的生產方法主 要有萃取法、化學合成法、酶法和發酵法。其中發酵法是最具潛力的方法。日本在20世紀80年代已經實現了 GSH的工業化生產，我國發酵法生產谷胱甘肽起步較晚，目前仍停留在實驗室試驗階段，GSH發酵過程中發酵水平不高以及下游分離純化相關技術未取得實質性突破，使得谷胱甘肽的工業化生產在我國一直未能實現。由于谷胱甘肽在水溶液中極易被氧化，因此微生物細胞合成的谷胱甘肽一般存在于細胞中。酵母是谷胱甘肽合成最具潛力的微生物，且酵母富含蛋白質，在食品和醫藥工業中具有廣泛的用途。生產谷胱甘肽含量高的酵母既能作為食品和醫藥工業的原料，同時也可以提供豐富的功能性成分谷胱甘肽，對改善人體機能具有非常重要的作用。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是提供一種合成谷胱甘肽能力較強的菌株和富含谷胱甘肽的干酵母產品，有效解決微生物中酵母合成產率低及谷胱甘肽干酵母中谷胱甘肽含量低的問題，拓寬富含谷胱甘肽干酵母的應用范圍，提高產品附加價值。為了實現本專利技術，專利技術人通過大量試驗反復進行菌種選育研究，并終于獲得了一株合成谷胱甘肽能力較強的釀酒酵母iSaccharomyces cerevisiae)CCCG,已于2012年6月 11日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO.M2012215。形態學特征菌落白色，無光澤，扁平，呈草帽形，表面及邊緣粗糙，邊緣不整齊，濕潤粘膩，不容易挑起；正反面，邊緣與中央部位顏色一致。生理特性不僅可利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、糖蜜等碳源，還可利用可溶性淀粉作為碳源；具有硫酸鋅抗性標記。代謝特性代謝過程能積累產生谷胱甘肽本專利技術的涉及的高產谷胱甘肽的釀酒酵母iSaccharomyces cerevisiae ) CCTCC No. M2012215是按照如下方法獲得的親本為親株A :釀酒酵母cerevisiae CICC1251,親株B :熱帶假絲酵母Candida tropicalis CICC31709,實驗室保藏菌株。原生質體的制備將待融合的親株A和親株B在斜面培養基上活化兩次(斜面培養基葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，瓊脂20 g/L，pH6. 0,0.1MPa滅菌15min)，活化后接入搖瓶培養基(搖瓶培養基葡萄糖20 g/L, (NH4) 2S045 g/L，KH2PO4 I g/L, NaCl O.1 g/L, MgSO4O. 5 g/L, CaCl2 0.1 g/L，酵母粉 0. 2 g/L，0.1MPa 滅菌 15min)培養至對數生長期，5000rpm下離心收集細胞，將細胞懸浮于I mL無菌脫壁預處理液(O. 05mo I/L EDTA溶液與O. 1% β-巰基乙醇混合，用O. lmol/L檸檬酸緩沖液配制(O. lmol/L檸檬酸4. 7ml,O. lmol/L檸檬酸鈉15. 3ml混合，pH5. 8),0. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌，)中，使細胞數為IO7個/mL，30°C振蕩處理15 min，5000rpm下離心收集細胞；用1% (W/V)蝸牛酶加1% (W/V)纖維素酶(1%蝸牛酶和1%纖維素酶的配制方法用O. lmol/L檸檬酸緩沖液加0. 7mol/L KCl的高滲溶液配制，然后通過0. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌)復合酶酶解懸浮預處理過的細胞，30°C振蕩處理40 60 min ;當原生質體形成率達到90%以上后，力口入 4 mL 無菌 Tris-HCl 高滲緩沖液(Tris-HCl 高滲緩沖液0. 05mol/L Tris_HCl，pH 7. 4 (50mL0.1 mol/L三羥甲基氨基甲烷溶液與42mL 0.1 mol/L鹽酸均勻混合后加水稀釋至100 mL)，0.5mol/L鹿糖，0.05 mol/L CaCl2，然后通過0. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌)停止酶解，將離心管上下倒置兩次，搖勻后在轉速3000 rpm離心5 min收集酶解后的細胞，將收集的細胞用2 mL無菌Tris-HCl高滲緩沖液懸浮，得親株A、親株B的原生質體。 原生質體融合上述方法制得的原生質體，以1:1的比例各取親株A、親株B的原生質體液0.1 mL混合后加入0.8 mL無菌Tris-HCl高滲緩沖液，離心去上清液；然后，加入2mL促融劑溶液(促融劑配置方法PEG6000(聚乙二醇)30 g，溶于100 mL Tris-HCl高滲緩沖液，0. 22 μπι微孔濾膜過濾除菌)，輕搖混合，30°C靜置保溫I h ；3000 rpm離心，收集沉淀，用液體高滲基本培養基(液體高滲基本培養基(g/L):葡萄糖20，(NH4)2SO4 5，KH2PO41，NaCl 0.1 , MgSO4 0. 5, CaCl2 0.1,酵母膏 0.2，蔗糖 170，0.1MPa 滅菌 15min)洗滌兩次，將沉淀再懸于液體高滲基本培養基中；取0.1 mL液體高滲基本培養基菌懸液于4mL高滲基礎培養基軟瓊脂(上層)(高滲基礎培養基軟瓊脂(g/L):葡萄糖20，(NH4)2SO4 5，KH2PO4 1，NaCl 0.1 , MgSO4 0. 5，CaCl2 0.1，酵母膏 0.2，蔗糖 170，瓊脂 10 0.1MPa滅菌15min)中，搖勻迅速倒入底層為高滲基礎固體培養基(高滲基礎固體培養基(g/L):葡萄糖 20，(NH4)2SO4 5，KH2PO4 1，NaCl 0.1 , MgSO4 0. 5，CaCl2 0.1，酵母膏 0. 2，蔗糖170，瓊脂20 0.1MPa滅菌15min)的平板上，30°C培養4 5天。挑出平板上的單菌落，接入基礎固體培養基(基礎固體培養基(g/L):葡萄糖20，(NH4)2SO4 5，KH2PO4 1，NaCl0.1 , MgSO4 0. 5，CaCl2 0. 1，酵母膏0. 2，瓊脂20 0.1MPa滅菌15min)的斜面試管，保藏備用。融合子的篩選將上述保藏菌株接入到在淀粉選擇平板(淀粉選擇平板培養基淀粉 20，(NH4)2SO4 5，KH2PO4 1，NaCl 0.1 , MgSO4 0. 5，CaCl2 0.1，酵母膏 0.2，瓊月旨20 0.1MPa滅菌15min)上，經過兩次淀粉選擇平板的篩選，得到融合較好的菌株R2和R7(實驗室編號，下同)。通過本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種釀酒酵母（Saccharomyces?cerevisiae）CCCG，其特征在于，它的保藏編號為CCTCC?No.M2012215。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：蔡俊，王常高，林建國，胡瑛，
申請(專利權)人：湖北工業大學，
類型：發明
國別省市：