釀酒酵母及釀酒酵母制備琥珀酸的方法技術(shù)

本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)公開(kāi)了一種釀酒酵母，該釀酒酵母被保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。一種釀酒酵母制備琥珀酸的方法，包括：釀酒酵母接種至種子培養(yǎng)基上，在100％CO2環(huán)境中，培養(yǎng)70?80h，得到發(fā)酵培養(yǎng)液；加入硅藻土，過(guò)濾出菌絲體，用四氯化碳浸泡菌絲體，得到提取液；陰離子交換樹(shù)脂吸附，水作為洗脫液洗脫，收集洗脫液，加入異丙醇溶液或硫酸氫銨溶液，放置0℃條件下結(jié)晶12～15h，過(guò)濾得到白色晶體，即為琥珀酸，其純度不低于99.0％。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)對(duì)自制工程菌株發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，提高了琥珀酸的產(chǎn)量。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專(zhuān)利技術(shù)涉及一種釀酒酵母及釀酒酵母制備琥珀酸的方法。
技術(shù)介紹
琥珀酸是一種常見(jiàn)的天然有機(jī)酸，其分子式為C4H6O4，相對(duì)分子量118.09，琥珀酸本身的性質(zhì)使它具有許多重要的化學(xué)反應(yīng)特性，如鹵化、脫水、酯化、磺化、酰化、氧化、還原等等，這就使琥珀酸能廣泛地應(yīng)用于合成化工、醫(yī)藥、食品等行業(yè)。在食品行業(yè)中，自從諾貝爾獎(jiǎng)獲得者Robert證明琥珀酸對(duì)人類(lèi)新陳代謝有積極的作用，并且不會(huì)在體內(nèi)富集之后，琥珀酸就開(kāi)始被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)。它可以作為酸味劑、抑菌劑以及pH改良劑、增稠劑等；在醫(yī)藥行業(yè)中，琥珀酸可作為pH值調(diào)節(jié)劑，防腐劑，助溶劑等，還可以用來(lái)合成解毒劑、鎮(zhèn)靜劑、抗生素以及氨基酸和維生素等藥物等；在化工行業(yè)中，琥珀酸可以用作離子螯合劑，用于電鍍行業(yè)以防止金屬的點(diǎn)蝕和溶蝕；另外，琥珀酸的衍生物也是良好的表面活性劑，是去垢劑、肥皂和破乳劑的組成成分，還可以用來(lái)生產(chǎn)脫毛劑、清洗劑、牙膏等；在飼料行業(yè)中，琥珀酸可以作為反芻動(dòng)物和單胃動(dòng)物的飼料添加劑來(lái)替代抗生素，從而減少抗生素的使用；能夠作為抑菌劑殺滅家畜腸道有害微生物菌群；可以有效地降低飼料的pH值，提高消化率。目前，琥珀酸在化工行業(yè)的市場(chǎng)占據(jù)琥珀酸市場(chǎng)的主體部分，而運(yùn)用于化工行業(yè)的琥珀酸都是通過(guò)化學(xué)法生產(chǎn)的，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的琥珀酸基本用于食品行業(yè)。然而從環(huán)保成木及資源限度方面考慮，化學(xué)方法合成琥珀酸有諸多缺點(diǎn)，比如原材料緊缺、資源不可再生、污染嚴(yán)重以及成本高不足。相比化學(xué)合成法，微生物發(fā)酵法有幾大優(yōu)勢(shì)。一方面，發(fā)酵法利用糖類(lèi)等一些可再生資源，大大降低對(duì)石油及其他不可再生資源的依賴(lài)。其次，運(yùn)用發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸將大大降低生產(chǎn)成本。據(jù)報(bào)道，日本已經(jīng)采用新的發(fā)酵法進(jìn)行琥珀酸生產(chǎn)，該方法比用化學(xué)方法合成琥珀酸所需的成本降低了50％，通過(guò)進(jìn)一步的研究，有望繼續(xù)提高該發(fā)酵法的效能。另一方面，微生物發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的同時(shí)能固定CO2，如果發(fā)酵法能大規(guī)模實(shí)行，發(fā)酵過(guò)程中將大量利用大氣中的CO2，因CO2造成的溫室效應(yīng)也
將得到一定的遏制。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸具有廣闊的市場(chǎng)前景。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專(zhuān)利技術(shù)的一個(gè)目的是解決至少上述問(wèn)題，并提供至少后面將說(shuō)明的優(yōu)點(diǎn)。本專(zhuān)利技術(shù)還有一個(gè)目的是提供一種釀酒酵母及釀酒酵母制備琥珀酸的方法，其對(duì)自制工程菌株發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，提高了琥珀酸的產(chǎn)量。為了實(shí)現(xiàn)根據(jù)本專(zhuān)利技術(shù)的這些目的和其它優(yōu)點(diǎn)，提供了一種釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae SC54-62，所述釀酒酵母被保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為：CGMCC No.11733，保藏時(shí)間為：2015年11月25日。一種利用所述的釀酒酵母制備琥珀酸的方法，包括以下步驟：步驟一、種子培養(yǎng)：將權(quán)利要求1所述的釀酒酵母接種至種子培養(yǎng)基上，在100％CO2環(huán)境中、溫度為35～37℃、轉(zhuǎn)速為200～400r/min下，培養(yǎng)20～25h，得到種子培養(yǎng)液；其中，釀酒酵母接種量為1％～3％；步驟二、發(fā)酵培養(yǎng)：將種子培養(yǎng)液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基上，在100％CO2環(huán)境中，35～37℃、200～400r/min下，培養(yǎng)70-80h，得到發(fā)酵培養(yǎng)液；在發(fā)酵過(guò)程中，分別在發(fā)酵20h、35h、50h和65h時(shí)補(bǔ)加試劑葡萄糖，每隔1h測(cè)定發(fā)酵液中葡萄糖的含量，控制葡萄糖殘留控制在2.2％；其中，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為5.8～6.6，種子培養(yǎng)液的接種量為5％；步驟三、向發(fā)酵培養(yǎng)液加入硅藻土，過(guò)濾出菌絲體，用四氯化碳浸泡菌絲體，在50～70℃水浴條件下過(guò)濾兩次，每次過(guò)濾120～150min合并兩次濾液，得到提取液；其中，浸泡菌絲體的四氯化碳的體積為發(fā)酵液體積的5～10倍步驟四、蒸去提取液中的四氯化碳，得到固體，用乙酸乙酯萃取固體，在萃取過(guò)程中，用濃度為20％的氨水將乙酸乙酯的pH值控制在7.0，并且控制乙酸乙酯的溫度在15～35℃，收集乙酸乙酯相，濃縮酸乙酯相，得到第一濃縮液，將第一濃縮液經(jīng)過(guò)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，得第一預(yù)純化溶液，第一預(yù)純化溶液用四氯化碳溶液調(diào)制pH至7.5，得到第二預(yù)純化溶液，用陰離子交換樹(shù)脂吸附第二預(yù)純化溶液，吸附完畢用水作為洗脫液洗脫，收集洗脫液，將洗脫液濃縮至原洗脫液體積的1.5％，得到第二濃縮液，向第二濃縮液中加入異丙醇溶液或硫酸氫銨溶液，將第二濃縮液的pH調(diào)至1.5，放置0℃條件下結(jié)晶12～15h，過(guò)濾得到白色晶體，即為琥珀酸，其純度不低于99.0％。優(yōu)選的是，利用所述的釀酒酵母制備琥珀酸的方法中，所述種子培養(yǎng)基包括以下組
分：葡萄糖8～10g/L，酵母粉7～8g/L，酵母膏0.5～1.0g/L、酪蛋白0.5～1.5g/L、KH2PO4 3～5g/L、MgSO4 8～50g/L、NaCl 1～3g/L、CH3COONa 1～2g/L；且種子培養(yǎng)基在0.1Mpa下，滅菌25～30min。優(yōu)選的是，利用所述的釀酒酵母制備琥珀酸的方法中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下組分：麥芽糖50～55g/L、D-山梨醇15～20g/L、酵母膏22～27g/L、MgCO3 40～43g/L、(NH4)2S043～5g/L、KH2PO4 3～5g/L、FeS04﹒7H2O 1～3g/L，且發(fā)酵培養(yǎng)基在0.1Mpa下，滅菌25～30min。優(yōu)選的是，利用所述的釀酒酵母制備琥珀酸的方法中，所述步驟四中，陰離子交換樹(shù)脂與洗脫液的體積比為1:2。優(yōu)選的是，利用所述的釀酒酵母制備琥珀酸的方法中，所述步驟四中，加入到第二縮液中加入異丙醇溶液的體積為第二濃縮液體積的3～4倍。本專(zhuān)利技術(shù)至少包括以下有益效果：第一、本專(zhuān)利技術(shù)為微生物發(fā)酵法制備琥珀酸，是一種重要的化工產(chǎn)品，成本低廉，可廣泛應(yīng)用到醫(yī)藥、食品、化工等領(lǐng)域，對(duì)它的研究開(kāi)發(fā)具有很好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和應(yīng)用潛力；第二、本專(zhuān)利技術(shù)對(duì)高產(chǎn)菌株發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，確定了厭氧發(fā)酵的補(bǔ)料分批發(fā)酵策略，提高了琥珀酸的產(chǎn)量，發(fā)酵水平平均不低于97.2g/L，達(dá)到國(guó)內(nèi)領(lǐng)先水平；第三、本專(zhuān)利技術(shù)采用離子交換和結(jié)晶法，可在較低溫度下進(jìn)行，污染小，提取時(shí)間短，琥珀酸損失少，除去乳酸、甲酸、乙酸等副產(chǎn)物，有效提高了琥珀酸的得率，整個(gè)工藝提取率轉(zhuǎn)化率為0.90-0.99g/g。本專(zhuān)利技術(shù)的其它優(yōu)點(diǎn)、目標(biāo)和特征將部分通過(guò)下面的說(shuō)明體現(xiàn)，部分還將通過(guò)對(duì)本專(zhuān)利技術(shù)的研究和實(shí)踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。附圖說(shuō)明圖1為本專(zhuān)利技術(shù)所述的釀酒酵母制備琥珀酸的流程圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖對(duì)本專(zhuān)利技術(shù)做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說(shuō)明書(shū)文字能夠據(jù)以實(shí)施。應(yīng)當(dāng)理解，本文所使用的諸如“具有”、“包含”以及“包括”術(shù)語(yǔ)并不配出一個(gè)或多個(gè)其它元件或其組合的存在或添加。實(shí)施例1、1、一種釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae SC54-62，其分類(lèi)命名為釀酒酵母，所述釀
酒酵母被保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為：CGMCC No.11733，保藏時(shí)間為：2015年11月25日；保藏單位地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。實(shí)施例2、如圖1所示，本專(zhuān)利技術(shù)提供一種實(shí)施例1所述的釀酒酵母制備琥珀酸的方法，包括以下步驟：經(jīng)過(guò)紫外、紫外-亞硝基胍(NTG)復(fù)合誘變篩選得到復(fù)合誘變后的釀酒酵母釀本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種釀酒酵母Saccharomyces?cerevisiae?SC54?62，其特征在于，所述釀酒酵母被保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為：CGMCC?No.11733，保藏時(shí)間為：2015年11月25日。

【技術(shù)特征摘要】
2016.04.05 CN 20161020731141.一種釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae SC54-62，其特征在于，所述釀酒酵母被保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為：CGMCC No.11733，保藏時(shí)間為：2015年11月25日。2.一種利用權(quán)利要求1所述的釀酒酵母制備琥珀酸的方法，其特征在于，包括以下步驟：步驟一、種子培養(yǎng)：將權(quán)利要求1所述的釀酒酵母接種至種子培養(yǎng)基上，在100％CO2環(huán)境中、溫度為35～37℃、轉(zhuǎn)速為200～400r/min下，培養(yǎng)20～25h，得到種子培養(yǎng)液；其中，釀酒酵母接種量為1％～3％；步驟二、發(fā)酵培養(yǎng)：將種子培養(yǎng)液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基上，在100％CO2環(huán)境中，35～37℃、200～400r/min下，培養(yǎng)70-80h，得到發(fā)酵培養(yǎng)液；在發(fā)酵過(guò)程中，分別在發(fā)酵20h、35h、50h和65h時(shí)補(bǔ)加試劑葡萄糖，每隔1h測(cè)定發(fā)酵液中葡萄糖的含量，控制葡萄糖殘留控制在2.2％；其中，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為5.8～6.6，種子培養(yǎng)液的接種量為5％；步驟三、向發(fā)酵培養(yǎng)液加入硅藻土，過(guò)濾出菌絲體，用四氯化碳浸泡菌絲體，在50～70℃水浴條件下過(guò)濾兩次，每次過(guò)濾120～150min合并兩次濾液，得到提取液；其中，浸泡菌絲體的四氯化碳的體積為發(fā)酵液體積的5～10倍；步驟四、蒸去提取液中的四氯化碳，得到固體，用乙酸乙酯萃取固體，在萃取過(guò)程中，用濃度為20％的氨水將乙酸乙酯的pH值控制在7.0，并且控制乙酸乙酯的溫度在15～35℃，收集乙酸乙酯相，濃縮酸乙酯相，得到第一濃縮液，將第一濃縮液經(jīng)過(guò)0.4...

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張春穎，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：西藏天虹科技股份有限責(zé)任公司，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：西藏;54