生產亞麻酸的圓紅冬孢酵母及其制備方法技術

本發明專利技術公開一種生產α?亞麻酸的圓紅冬孢酵母及其制備方法。本發明專利技術通過從多形漢遜酵母(Hansenula?polymorpha)胞內克隆得到活性較高的Δ15脫飽和酶基因，連接至經過改造的植物雙元表達載體pCAMBIA1300，轉化到根癌農桿菌(Agrobacterium?tumefaciens?LBA4404)胞內并通過共培養將Δ15脫飽和酶基因結合至圓紅冬孢酵母的基因組上，實現多形漢遜酵母Δ15脫飽和酶在圓紅冬孢酵母胞內的過表達，從而增加α?亞麻酸在圓紅冬孢酵母胞內的產量。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及α-亞麻酸的生產領域，尤其涉及一種生產α-亞麻酸的圓紅冬孢酵母及其制備方法和生產α-亞麻酸的方法。
技術介紹
α-亞麻酸(cisΔ9,12,15，英文縮寫ALA)屬于ω-3系列多不飽和脂肪酸，為全順式9,12,15-十八碳三烯酸，它在人體內不能合成，必須從體外食物中獲取，多以不飽和甘油酯的形式存在于亞麻籽、沙棘籽、大豆等植物中。α-亞麻酸在人體內通過一系列的碳鏈延長和脫飽和反應能夠被轉化為機體必需的二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，然而，α-亞麻酸比EPA和DHA的作用更好并且更安全，它是構成人體組織細胞的主要成分，如果人體缺乏，便會引起機體脂質體代謝紊亂，會直接導致疲勞、健忘、視力減退、免疫力下降、動脈粥樣硬化等癥狀的發生。目前國內外已有明確報道：如果嬰幼兒童或青少年缺乏α-亞麻酸，會嚴重影響智力的正常發育。美國國家食品藥品監督管理局的研究證明，缺乏α-亞麻酸將導致兒童大腦及視網膜發育遲緩，營養吸收不均衡或者不能被有效吸收，同時會導致注意力不集中和智力發育遲緩、弱視、多動癥、肥胖、厭食以及免疫力低下等多種癥狀和疾病。成年人缺乏α-亞麻酸，體內的維生素、礦物質、氨基酸、蛋白質等物質不能被有效吸收和利用，甚至會出現代謝紊亂癥狀。從自然界植物中提取α-亞麻酸的成本高且產率低，不適合工業化生產的需求。近年來利用微生物生產多不飽和脂肪酸成為研究熱
點。利用微生物生產多不飽和脂肪酸具有簡單、過程可控、易放大、不受天氣環境影響等優點。圓紅冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)是自然界中為數不多的可以合成多不飽和脂肪酸的酵母，這種產油酵母具有營養需求簡單、易進行放大和高密度培養、遺傳背景比較清楚等優勢。圓紅冬孢酵母胞內可以合成并積累α-亞麻酸，然而產量并不高，因而強化圓紅冬孢酵母生產α-亞麻酸具有重要的研究和應用價值。目前利用培養和發酵優化的方法對于增加圓紅冬孢酵母生產α-亞麻酸的效果并不理想，所以必須從基因水平強化圓紅冬孢酵母胞內α-亞麻酸的代謝途徑，進而達到增加α-亞麻酸產量的目的。然而，圓紅冬孢酵母屬于粘紅酵母菌，對于這類酵母的遺傳操作方法比較有限。另外，α-亞麻酸在圓紅冬孢酵母胞內的合成途徑是先由硬脂酸經過Δ9脫飽和酶(FAD9)催化生成油酸；再由Δ12脫飽和酶(FAD12)催化油酸生成亞油酸；最后經過Δ15脫飽和酶(FAD15)催化生成α-亞麻酸。在這條合成途徑中Δ15脫飽和酶是主要的限速酶，正是由于圓紅冬胞酵母胞內Δ15脫飽和酶的低活性限制了α-亞麻酸的產量。但是如何增強Δ15脫飽和酶的活性，強化從亞油酸到α-亞麻酸的合成途徑，進而增加圓紅冬胞酵母合成α-亞麻酸的產量是長期以來一直面臨的重要難題。
技術實現思路
為了克服現有技術無法大幅度提高圓紅冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides ACCC 20341)生產α-亞麻酸的問題，本申請的專利技術人發現，從多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)胞內克隆得到的Δ15脫飽和酶基因在圓紅冬孢酵母表達時顯示出高活性，將其連接至植物雙元表達載體pCAMBIA1300，轉化到根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens LBA4404)胞內，并通過共培養將Δ15
脫飽和酶基因轉化至圓紅冬孢酵母，實現具有高活性的多形漢遜酵母Δ15脫飽和酶在圓紅冬孢酵母胞內的過表達，從而能夠強化圓紅冬孢酵母生產α-亞麻酸的能力。具體地，本專利技術提供以下內容。本專利技術的一方面，提供一種圓紅冬孢酵母菌株，其包含多形漢遜酵母Δ15脫飽和酶基因表達元件。在一個優選實施方案中，多形漢遜酵母Δ15脫飽和酶基因表達元件包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。在另一優選實施方案中，本專利技術的圓紅冬孢酵母菌株能夠過表達具有高活性的多形漢遜酵母Δ15脫飽和酶。在另一優選實施方案中，本專利技術的圓紅冬孢酵母菌株具有強化α-亞麻酸生產的能力。本專利技術的另一方面，提供一種圓紅冬孢酵母菌株的制備方法，其包括：將表達多形漢遜酵母Δ15脫飽和酶的基因或其片段引入圓紅冬孢酵母菌株，從而強化所述圓紅冬孢酵母菌株的α-亞麻酸生產能力。優選地，所述表達多形漢遜酵母Δ15脫飽和酶的基因具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。在一個優選的實施方案中，圓紅冬孢酵母菌株的制備方法包括：Δ15脫飽和酶基因表達載體pCAMBIA-FAD15的構建，其中所述pCAMBIA-FAD15包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；利用所述pCAMBIA-FAD15質粒轉化根癌農桿菌；將所述轉化的根癌農桿菌與所述圓紅冬孢酵母共培養，從而將Δ15脫飽和酶基因轉化至所述圓紅冬孢酵母的基因組。優選地，所述pCAMBIA-FAD15進一步包含潮霉素抗性基因(HYGR)表達元件。優選地，所述潮霉素抗性基因表達元件由GPD基因的啟動子、潮霉素抗性基因和CaMV終止子組成。優選地，所述潮霉素抗性基因具SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。本專利技術的再一方面，提供一種生產α-亞麻酸的方法，其包括培養本專利技術所述的圓紅冬孢酵母菌株的步驟。在優選地實施方案中，生產α-亞麻酸的方法包括以下步驟：1)利用YEPD培養基培養活化的圓紅冬孢酵母菌株；2)收集步驟1)培養而得到的圓紅冬孢酵母菌株，接種至補料發酵培養基進行補料發酵，所述補料發酵培養基含有碳源、氮源和無機鹽，補料發酵過程中，總碳氮比始終維持在100:0.7～1.5。活化的圓紅冬孢酵母菌株可以直接采用活化狀態的菌株，也可由保藏狀態的菌株活化而來。所述YEPD培養基或稱為YPD培養基，即，酵母浸出粉胨葡萄糖培養基(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium)，按照常規配方配置即可。優選地，按照如下配方配置：8～12g/L酵母粉，8～20g/L蛋白胨，15～25g/L葡萄糖，pH為5.8～6.0。若制固體培養基，加入10～20g/L瓊脂粉,優選為15g/L瓊脂粉。在本專利技術的一個優選實施方式中，YEPD培養基按照如下配方配置：10g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，pH＝5.8～6.0。步驟1)和步驟2)可以在發酵罐中進行。步驟2)中，補料發酵是指，通過補料流加所述碳源維持所需的碳氮比。根據本專利技術所述的生產α-亞麻酸的方法，優選地，步驟2)中，所述碳源為含有葡萄糖和木糖的混合碳源，所述氮源為谷氨酸鈉或蛋白胨，所述無機鹽含有鉀元素、鎂元素和磷元素。根據本專利技術所述的生產α-亞麻酸的方法，優選地，步驟2)中，碳源為含有15～25g/L葡萄糖和25～35g/L木糖的混合碳源，氮源為5.8～6.5g/L的谷氨酸鈉或4.6～5.5g/L的蛋白胨，所述無機鹽包括0.3～0.7wt％的KH2PO4、0.1～0.3wt％的K2HPO4和0.3～0.7wt％的MgCl2。以上各成分的含量是指各成分在補料發酵培養基中的含量。
補料發酵過程中，通過流加所述碳源的水溶液(即，通過流加含有15～25g/L的葡萄糖和25～35g/L的木糖的混合本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種圓紅冬孢酵母菌株，其包含多形漢遜酵母Δ15脫飽和酶基因表達元件。

【技術特征摘要】
1.一種圓紅冬孢酵母菌株，其包含多形漢遜酵母Δ15脫飽和酶基因表達元件。2.根據權利要求1所述的圓紅冬孢酵母菌株，其中所述多形漢遜酵母Δ15脫飽和酶基因表達元件包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。3.根據權利要求1或2所述的圓紅冬孢酵母菌株，其中所述圓紅冬孢酵母菌株過表達具有活性的多形漢遜酵母Δ15脫飽和酶。4.根據權利要求1或2所述的圓紅冬孢酵母菌株，其中所述圓紅冬孢酵母菌株具有強化α-亞麻酸生產的能力。5.一種圓紅冬孢酵母菌株的制備方法，其包括：將SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列引入圓紅冬孢酵母菌株，從而使所述圓紅冬孢酵母菌株過表達具有活性的多形漢遜酵母Δ15脫飽和酶。6.根據權利要求5所述的方法，其包括：Δ15脫飽和酶基因表達載體的構建，其中所述表達載體包含SEQ ID NO:1、SE...

【專利技術屬性】
技術研發人員：祁峰，黃建忠，張明亮，孫磊，江賢章，鄒麗梅，
申請(專利權)人：福建師范大學，
類型：發明
國別省市：福建;35