本發明專利技術屬于微生物領域，公開了一株降解棉酚的紅冬孢酵母及其應用。紅冬孢酵母HJ-D-20(Rhodosporidium?paludigenum)，該菌株于2010年11月26日保藏于中國微生物菌種保存管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC?No.4372。該菌株對醋酸棉酚的降解率為90.78％，CP提高率為24.68％，并且該菌株有很好的穩定性，使棉籽粕達到使用標準，加大棉籽粕的利用率。本發明專利技術對于緩解蛋白質資源緊缺，減少大豆進口及棉籽粕廉價出口日本，控制蛋白質資源價格的不斷攀升，增強國力，具有重要的意義。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于微生物領域，涉及一株降解棉酚的紅冬孢酵母及其應用。
技術介紹
棉籽餅粕是重要的植物蛋白質飼料資源，在一定程度上可以彌補蛋白質資源的不足，但由于棉籽餅粕中存在棉酚、氨基酸含量低且不平衡和粗纖維含量高等原因限制了其在養殖業中的大量廣泛使用。飼糧中包含一定量的游離棉酚(free gossypol, FG)會對動物生長、繁殖以及胃腸道和體組織器官產生負面作用。利用微生物發酵棉籽粕，不但可使re 含量大大降低而起到脫毒作用，而且可以顯著提高棉籽粕的營養價值，使其在畜禽飼料中使用量顯著增加。顧賽紅等和Zhang等研究表明，微生物發酵棉籽粕降低了棉粕中棉酚含量，同時提高了蛋白質和氨基酸等營養物質的含量及消化吸收率。Wu等和Kornegay等亦有類似的研究結果。張文舉等利用熱帶紅冬孢酵母菌ZD-3對棉籽粕進行固體發酵，脫毒率高達91. 91%。目前微生物發酵棉籽粕的研究，主要集中在對脫毒菌株的篩選及其脫毒效果和脫毒后粗蛋白等常規營養成分變化的研究。但是微生物發酵棉籽粕仍存在諸多問題發酵菌株性能不穩定、耐受性低；微生物的脫毒機理復雜，高效脫毒菌株降解棉酚的詳細機制仍然不清楚；菌種發酵棉籽粕及其工藝條件尚缺乏充分的理論基礎。本實驗室已篩選出棉酚降解率為71. 90%、粗蛋白提高28. 96%的復合發酵菌株，單一菌株最高脫毒率達88. 88% (夏新成，李貴強，滕安國，等.復合發酵棉籽粕菌種篩選、鑒定及其發酵工藝參數優化研究，中國糧油學報，2010，，25(1) :91-97)。優良的菌種是發酵工業的基礎和關鍵，因此， 選育性能優良的生產菌種是改善發酵產品質量的關鍵。所以本專利技術通過誘變，進一步改良、 篩選菌種，以期得到棉酚降解率更高的優良菌株，為棉籽餅粕的廣泛安全使用提供基礎。
技術實現思路
本專利技術的目的在于針對現有技術中棉酚降解菌性能不穩定的缺陷，提供一株穩定性高、棉酚降解能力強的棉酚降解菌株。本專利技術生產的降解菌株可極顯著降低棉籽粕的棉酚含量，提高了棉籽粕的營養價值，豐富了高效降解棉籽粕毒性的菌種資源。本專利技術成功地解決了飼料工業和養殖業中棉籽粕飼用率低、蛋白質飼料資源緊缺的問題，為棉籽餅粕的廣泛安全使用提供了基礎。本專利技術的另一目的是提供該棉酚降解菌株的應用。本專利技術的目的可通過如下技術方案實現紅冬孢酵母HJ-D-20 (Rhodosporidium paludigenum)，該菌株于 2010 年 11 月 26 日保藏于中國微生物菌種保存管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC No. 4372。紅冬孢酵母HJ-D-20 (CGMCC No. 4372)主要形態學特性為紅色，圓形。紅冬孢酵母HJ-D-20 (CGMCC No. 4372)主要培養學特性為該菌株能在馬鈴薯瓊脂培養基中生長，能在查氏培養基中生長。紅冬孢酵母HJ-D-20 (CGMCC No. 4372)主要生理生化特性為該菌株能發酵葡萄糖；能以0. 4%醋酸棉酚為唯一碳源進行生長。該菌株(CGMCCNo. 4372) 16srDNA 的 Genbank 登錄號為 AF444493. 1。經菌種鑒定， HJ-D-20為酵母菌目酵母菌科紅冬孢酵母屬Rhodosporidium paludigenum。在實驗室三角瓶培養條件下紅冬孢酵母HJ-D-20 (CGMCC No. 4372)對游離棉酚的降解率達90%以上，棉籽粕re含量較發酵前極顯著降低(p <o.oi)，cp含量亦極顯著提高(P < 0. 01)。因此，本專利技術所述的紅冬孢酵母HJ-D-20 (CGMCC No. 4372)可在生物降解游離棉酚中應用。本專利技術所述的紅冬孢酵母HJ-D-20 (CGMCC No. 4372)可在高濃度游離棉酚含量的棉籽粕的生物處理中應用。有益效果本試驗用紫外線、硫酸二乙酯處理原始菌株，篩選分離到一株耐高濃度棉酚的優勢菌紅冬孢酵母HJ-D-20 (CGMCC No. 4372)，對其生物學特性和耐棉酚機理進行了初步研究，并在棉籽粕的發酵工藝中得到了成功應用。該菌株克服了現有棉酚降解菌性能不穩定的缺陷，在篩選培養基中傳代3代后，初篩中是優勢菌株，復篩中依然是優勢菌株，說明其具有良好的穩定性。并且該菌株對醋酸棉酚的降解率為90. 80%,CP提高率為24. 59%，使棉籽粕達到使用標準，加大棉籽粕的利用率。該降解菌株的發酵底物可以部分代替豆粕，緩解蛋白質資源的不足。因此，本專利技術對于緩解蛋白質資源緊缺，減少大豆進口及棉籽粕廉價出口日本，控制蛋白質資源價格的不斷攀升，增強國力，具有重要的意義。使用本專利技術高濃度醋酸棉酚降解菌株生物降解游離棉酚，具有生產使用成本低， 使用方便，去除效果好的優點，因此紅冬孢酵母HJ-D-20 (CGMCC No. 4372)適合在動物飼料的發酵工藝中投加使用，可以縮短生化處理系統的啟動時間，并提高處理效果。菌種保藏信息紅冬孢酵母HJ-D-20 (Rhodosporidium paludigenum)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏號為CGMCC No. 4372，保藏日期為2010年11月26日。具體實施例方式實施例1菌種誘變及初篩1)菌種的復壯將原試驗獲得的于4°C下保藏的菌種紅酵母HJ-Y去掉液體石蠟，將其菌懸液ImL 接入加有IOOmL PDA液體培養基的250mL三角瓶中，于28°C恒溫汽浴搖床培養48h，轉速為 200r/min。該酵母HJ-Y的篩選方法同夏新成，李貴強，滕安國，等.復合發酵棉籽粕菌種篩選、鑒定及其發酵工藝參數優化研究，中國糧油學報，2010，，25(1) :91-97中的菌種篩選方法。2)菌株選定在超凈操作臺上，用接種環挑取復壯后菌液在PDA固體培養基平板上進行傳代培養，挑選生長良好、性狀穩定并呈單一菌落生長的純菌株。將純化的各單一菌株轉接在查氏培養基平板上，傳代5次后，保存菌種為誘變所用。 3)誘變出發菌株的預培養將選定的誘變出發菌株接種于0.3%棉酚無糖查氏培養基平板上，于30°C恒溫培養箱培養到對數期，同時保存菌種。挑取對應平板上的菌落，通過無菌操作配制成濃度為 IO8個/mL的菌懸液，接種ImL菌懸液于盛有IOOmLO. 3%棉酚無糖查氏培養基的250mL三角瓶中，在30°C、200r/min下搖床培養，在無菌條件下用pH為6. 0的無菌磷酸緩沖溶液配制菌懸液，顯微計數板計數，調整菌體濃度到約IO7個/mL。4)紫外誘變時間的選擇紫外燈功率為15W，波長254nm，紫外燈距培養皿30cm，照射時間分別為0、20、25、 30、35、45、60、90、120s。照射完后的菌液用黑布包好，并于4°C冰箱靜置30min，防止經紫外線照射損傷的DNA被可見光修復。在紅外燈下分別取未照射的菌懸液(作為對照)和已經紫外照射過的菌懸液各 0. 5mL，進行梯度稀釋，分別取10-4、10_5、10-6稀釋度的稀釋液涂布于對應的固體篩選培養基上，在30°C的恒溫培養箱中倒置培養3-5d (用黑袋子包好平板)。通過平板菌落計數法計算各菌株的致死率。5)硫酸二乙酯(DES)誘變時間選擇誘變出發菌種本文檔來自技高網...
【技術保護點】
１．一種紅冬孢酵母ＨＪ－Ｄ－２０（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｌｕｄｉｇｅｎｕｍ），該菌株于２０１０年１１月２６日保存于中國微生物菌種保存管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．４３７２。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：高峰，林海晶，夏新成，江蕓，周光宏，
申請(專利權)人：南京農業大學，
類型：發明
國別省市：84
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