本發明專利技術公開了一種產葡萄糖氧化酶的基因工程菌及其建方法與應用，屬于基因工程技術領域。本發明專利技術采用重組DNA技術將黑曲霉葡萄糖氧化酶（GOD）基因克隆連接到畢赤酵母表達載體pPIC9K，并轉化Pichia?pastoris?GS115，經篩選鑒定得到一株可以產較高活性葡萄糖氧化酶的重組畢赤酵母Pichia?pastoris?GS115-pPIC9K-GOD，保藏編號為CCTCC?NO：M2012266。該菌株表達的葡萄糖氧化酶在搖瓶中的酶活為52U/mL，比野生菌的酶活提高了近24倍，為葡萄糖氧化酶的大規模生產奠定了良好的基礎。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一株產葡萄糖氧化酶的基因工程菌及其構建與應用，特別是一株誘導表達葡萄糖氧化酶基因的工程菌及其構建方法和應用。
技術介紹
葡萄糖氧化酶是生物領域中最主要的工具酶之一。自1967年Updike和Hicks將 GOD固定在Clark氧電極表面，將其應用于血糖測定以來，GOD被廣泛應用于食品、飼料、醫藥等許多相關領域。在食品工業中，由于氧的存在，引起許多不利于產品質量的化學反應，并為許多微生物生長創造了條件。目前，許多國家已將GOD作為工人的安全抗氧劑而廣泛應用于各種食品和食品加工工藝中。雖然用途多樣，GOD的作用主要在于除葡萄糖、除氧、形成過氧化氫、形成葡萄糖酸四個方面。利用其專一氧化酶的原理，制成葡萄糖氧化酶分析儀，能快速準確簡易地測定各種食品中的葡萄糖含量，指導生產。在醫藥工業中，GOD作為試劑盒、酶電極等用于血清(漿)、尿液及腦脊液中葡萄糖的體外定量分析；G0D制成的酶制劑還可用于除去或緩解牙斑、牙垢和齲齒的形成防止口腔疾病和牙病的發生。此外，由于可以催化生成H2O2，還可用于對H2O2敏感的淋巴瘤的導向目標的治療。GOD還是一種新型的酶飼料添加劑，能夠改善動物腸道環境，調節飼糧消化，促進動物生長。含葡萄糖氧化酶、乳酸過氧化物和乳鐵蛋白的混合飼料添加劑，可用于預防牲畜胃腸道感染、腹瀉，并有促進動物生長作用。從動植物組織中提取GOD有一定的局限，酶量亦不豐富；細菌GOD產酶量少；一般采用黑曲霉(具有GRAS資格)和青霉屬菌株作為GOD生產菌。我國及美國均采用點青霉及產黃青霉生產G0D,日本常用尼崎青霉,俄羅斯用生機青霉,近年報道膠霉屬(Clioctadium)、 擬青霉 屬(Paecilomyces)和帚霉屬(Scopulariopsis)也能生產G0D。產量低、酶活低、檢測方法復雜是GOD產業化的限制性因素，國內外為此做了大量工作并取得了明顯進展。目前國外生產的GOD廠家主要是德國的Boehringer和日本的 TOYOBO0規模化生產高活性的GOD還有困難。發酵生產GOD的同時產生大量雜蛋白，分離提取復雜，成本聞。
技術實現思路
本專利技術提供了一株產葡萄糖氧化酶的基因工程菌，已于2012年7月I日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏地址為中國武漢、武漢大學，保藏編號為CCTCC Ν0:Μ 2012266，分類學命名為巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115-pPIC9K_G0D。本專利技術還提供了一株產葡萄糖氧化酶基因工程菌的構建方法，包括如下步驟I)根據本實驗室篩選保藏的黑曲霉CCTCC NO M2011291的基因為模版設計引物， 獲得GOD基因；2)將GOD基因連接到畢氏酵母表達載體PPIC9K，得到重組質粒pPIC9K_G0D ；3)重組載體轉化 Pichia pastoris GS115。葡萄糖氧化酶酶活測定方法G0D活性測定一般采用鄰-聯(二)茴香胺分光光度法。在有氧條件下，GOD催化葡萄糖脫氫產生H2O2，在過氧化物酶(POD)作用下，氧供體鄰-聯(二)茴香胺(DH2)被氧化成棕色產物。測540nm處吸光度的變化，根據標準曲線的結果，計算葡萄糖氧化酶活力單位。本專利技術的有益效果該菌株表達的葡萄糖氧化酶在搖瓶中的酶活為52U/mL，比野生菌的酶活提高了近24倍，大大降低了生產成本，這為葡萄糖氧化酶的大規模生產奠定了良好的基礎。生物材料保藏一株產葡萄糖氧化酶的基因工程菌，該菌株為巴斯德畢赤酵母，命名為Pichia pastorisGS115-pPIC9K-G0D,已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO M2012266，保藏日期為2012年7月I日。附圖說明圖1 :搖瓶中不同甲醇誘導濃度下的隨時 間產葡萄糖氧化酶的能力。圖3 :重組GOD的最適溫度及溫度穩定性。圖3 :重組GOD的最適pH及pH穩定性。具體實施方式實施例1重組菌的構建及鑒定根據本實驗室篩選保藏的黑曲霉CCTCC NO M2011291的基因為模版設計引物，獲得GOD基因，用限制性內切酶SnaB I和Not I雙酶切消化純化后的GOD基因和載體pPIC9K， 用T4DNA連接酶于16°C過夜連接，連接產物用化學轉化法轉化宿主菌JM109，轉化菌液涂布在含有卡那霉素(30mg/mL)的LB平板上，37°C過夜培養，以GOD-F和GOD-R為引物進行菌落PCR的方法鑒定陽性克隆子，最終獲得含有GOD基因的重組表達質粒pPIC9K-G0D，用雙酶切進行驗證。將重組質粒pPIC9K-G0D電擊轉化Pichia pastoris GS115感受態細胞，得到基因工程菌，并經過鑒定命名為Pichia pastoris GS115_pPIC9K_G0D。畢赤酵母的轉化采用電轉化法GS115于500mL YPD中培養至0D_=1. 2-1. 5， 1500g離心收集細胞；依次用400mL冰冷的無菌水洗兩次細胞，再用40mL冰冷的lmol/L山梨醇洗一次細胞，重懸細胞于ImL lmol/L山梨醇。100 μ L原生質體與5_10 μ g線性化質粒 DNA (Bgl II切)混合，轉入冰冷的電轉杯，放置5分鐘；電擊細胞與DNA的混合物(1. 5kv, 4. 2-4. 9ms);加入ImL冰冷的lmol/L山梨醇，繼續放置30min ;再加入0. 5mL SOS, 30° C放置2小時，偶爾搖動志菌體不易沉淀；用lmol/L山梨醇稀釋菌體后涂布于固體MD培養基。 30° C培養4-6天后挑取單克隆。實施例2重組菌的酶活測定和蛋白電泳以實施例1獲得的酵母工程菌為生產菌株，活化后，將30°C、200rpm下培養到0D_ 在1. 6-1. 7之間的種子以2%的接種量轉入基本發酵培養基，于30°C、200rpm條件下培養；當OD值為1. 2-1. 5時，將酵母細胞轉入BMMY培養基中誘導蛋白的產生。培養基種子和斜面培養基為YPD培養基(IL):胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，葡萄糖20g ;斜面培養基添加瓊脂20g ;基本發酵培養基為BMGY培養基(1L):胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甘油10mL，YNB 13. 4g，IOOmM磷酸緩沖液(pH 6. O);誘導培養基為BMMY培養基(1L):胰蛋白胨20g，酵母抽提物IOg,甲醇8mL，YNB 13. 4g，IOOmM磷酸緩沖液(pH 6.0)；通過蛋白電泳(SDS-PAGE)得到一條分子量大小約為68kDa的蛋白條帶，同時在搖瓶中驗證不同甲醇誘導濃度下的隨時間產葡萄糖氧化酶的能力，最高酶活為52U/mL比野生菌的酶活(2. 2U/mL)提高了近24倍(圖1)。實施例3重組蛋白的酶學性質研究測定了重組GOD葡萄糖氧化酶在不同溫度下的酶活性和在20-80° C梯度溫度下的熱穩定性。結果表明，重組GOD的最適溫度為40° C，在20-60° C下均具有良好的熱穩定性，重組GOD在60 ° C下保溫3h，酶活仍可達80%，40 ° C下保溫3h，酶活殘留98%以上， 超過80° C后，酶活性損失嚴重(圖2)。P H主要通過改變酶的空間結構，影響酶分子活性中心基團的解離而影響酶的活性。重組GOD葡萄糖氧化酶分別在其最適溫度下、pH2. 0-10. O的本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一株產葡萄糖氧化酶的基因工程菌，于2012年7月1日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號CCTCC?NO：M?2012266。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：陳堅，顧磊，張娟，堵國成，沈依娜，李夢潔，李婷，王丹，丁雪，殷政，
申請(專利權)人：江南大學，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。