本發明專利技術提供了一種利用重組熱帶假絲酵母全細胞法生產木糖醇的方法，屬于生物工程技術領域。本發明專利技術所提供的用于木糖醇生產的基因工程菌是一種重組了外源木聚糖酶和木糖苷酶編碼基因的熱帶假絲酵母菌，可用于全細胞法生產木糖醇。本發明專利技術所保護的重組熱帶假絲酵母菌株在保持原有木糖醇轉化特性的基礎上，通過導入外源木聚糖酶和木糖苷酶編碼基因，在原始菌株中重構了木聚糖降解途徑，實現了木聚糖降解和木糖醇生產的耦合，獲得了以天然半纖維素原料為底物直接進行木糖醇全細胞法發酵生產的特性。本發明專利技術提供的利用重組熱帶假絲酵母全細胞法生產木糖醇的工藝簡單、成本低、條件溫和、能耗少、排污少，為木糖醇的生產開創了一條高效清潔無污染的工業化應用技術。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物工程
，涉及一種重組熱帶假絲酵母工程菌的構建及其在全細胞法生產木糖醇中的應用。
技術介紹
木糖醇(英文名xylitol,化學名稱1，2，3，4，5_pentahydroxypetane),又稱戍五醇。木糖醇作為木糖代謝的中間產物之一，是一種天然存在的五碳糖醇。木糖醇是一種高甜度低熱量的天然植物甜味劑，是一種高附加值的多元醇。木糖醇具有非致齲性，其在體內代謝不依賴胰島素，并具有保肝護肝的作用，被廣泛應用于口腔衛生、醫藥產品、食品添加劑等工業領域中。 目前已商品化的木糖醇生產都是采用化學轉化法。先將來源于不同生物質原料的半纖維素經酸或堿水解處理，使其中的多縮戊糖水解為D-木糖，然后經過復雜的脫毒、脫色等工序去除有害雜質，再在鎳催化劑作用下將水解液中的木糖進行加氫還原獲得木糖醇。化學法生產木糖醇產量低，在生產過程中需要高溫高壓，最后的催化液中成分復雜，木糖醇的提取純化比較困難。整個木糖醇生產工藝復雜，能耗高、污水排放量高，生產成本高，嚴重限制了木糖醇的生產和應用。微生物轉化生產木糖醇條件溫和，而且具有專一性好、轉化效率高、成本較低等優點，是替代化學法生產的理想途徑。一般來說，酵母被認為是最好的木糖醇轉化微生物。目前用于生產木糖醇的酵母菌株包括能夠代謝木糖的天然酵母菌，以及利用樹干畢赤氏酵母(Pichiastipitis)的木糖還原酶基因(XYLl)構建的重組釀酒酵母菌。這些酵母菌株轉化生產木糖醇時，其底物木糖仍要通過硫酸或堿水解半纖維素原料獲得，工藝過程仍需排放大量廢水，受到國家環保指標的嚴格限制。同時，硫酸或堿水解半纖維素原料獲得的水解液中，往往含有苯酚、糠醛等毒性物質及其他抗營養因子，對酵母細胞的生長具有極大的毒害作用，進而影響菌株發酵生產木糖醇的能力。因此，直接以半纖維素原料為底物，采用全細胞法清潔生產木糖醇成為未來木糖醇工業發展的必然趨勢，能夠解決半生物合成法的高能耗、高排污的行業問題，以實現過程的節能減排，推動生物質資源利用整體技術進步。
技術實現思路
本專利技術的目的是針對現有技術的上述不足，提供一種利用重組熱帶假絲酵母全細胞法生產木糖醇的方法。為實現上述目的，本專利技術的技術方案是提供一種重組熱帶假絲酵母工程菌株，分別克隆木聚糖酶(XYN)和木糖苷酶(XYL)編碼基因，利用分子生物學技術將這兩條基因片段的完整表達盒導入酵母表達載體PAUR123中，構建重組質粒pAUR123-Xyn-Xyl后轉入木糖利用型熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)中得到工程菌株。本專利技術的重組熱帶假絲酵母菌株C. tropicalis PNL能共表達木聚糖酶和木糖苷酶,這兩種酶均為胞外分泌型,活性高。該重組菌能直接利用玉米芯半纖維素為底物，實現全細胞法生產木糖醇，減少了環境污染。所述重組的熱帶假絲酵母菌株C. tropicalis PNL在全細胞法生產木糖醇中的應用。(I)菌體種子液的制備在搖瓶中按10-50%的裝液量加入種子培養基，所用種子培養基配方為木糖(5_50gL)、蛋白胨(I-IOgL)、酵母膏(l-10g/L)、K2HPO4(l_5g/L)、MgSO4 · 7H20 (O. 1-0. 5g/L)、CaCl2 (0. 1-0. 5g/L)，pH4. 5-6. 5，在 100-130°C下滅菌 10_30min后，在無菌條件下從活化平板上挑取C. tropicalis PNL單菌落接入上述搖瓶中，培養溫度為30-40°C，搖床轉速為150-300rpm，培養時間為12_30h，得到菌體種子液備用。優選的，種子培養基木糖含量為5_25gL,蛋白胨含量為3_8gL,酵母膏含量為2-6gL, K2HPO4 含量為 l-3g/L, MgSO4 · 7H20 含量為 O. 1-0. 3g/L, CaCl2 含量為 O. 1-0. 3g/L,pH4. 5-5. 5。優選的，種子培養基裝液量為15-35%。優選的，培養溫度為32_38°C。優選的，搖床轉速為160_200rpm。(2)木糖醇的全細胞法發酵生產在無菌條件下將上述步驟(I)制備好的菌體種子液，按1-15%的接種量接入盛有發酵培養基的搖瓶，裝液量為20-80%。所用發酵培養基配方為葡萄糖5-40g/L、蛋白胨5-40g/L、酵母膏5_30gL、玉米芯粉10_50g/L，pH4. 5-6. 5。控制發酵溫度為30-40°C，搖床轉速為150-300rpm，發酵時間為24_120h。優選的，發酵培養基葡萄糖含量為10_25g/L,蛋白胨含量為l_25g/L,酵母膏含量為 5-15g/L，玉米芯粉含量為 10-30g/L，pH4. 5-5. 5。優選的，發酵培養基裝液量為30-60%。優選的，接種量為3-10%。優選的，培養溫度為32_38°C。優選的，搖床轉速為160_200rpm。優選的，發酵時間為60_100h。本專利技術采用代謝工程的思想，通過基因工程手段獲得重組的熱帶假絲酵母工程菌株-C. tropicalis PNL,其出發菌株C. tropicalis CICC1779能高效地轉化木糖生產木糖醇。重組菌在保持原有木糖醇轉化特性的基礎上，通過導入外源木聚糖酶和木糖苷酶編碼基因，在原始菌株中重構了木聚糖降解途徑，實現了木聚糖降解和木糖醇生產的耦合，獲得了以天然半纖維素原料為底物直接進行木糖醇全細胞法發酵生產的特性。本專利技術中重組熱帶假絲酵母菌株的優點在于木聚糖酶基因和木糖苷酶基因均置于酵母組成型強表達啟動子PADHl的控制之下，不需要添加誘導劑，不必更換碳源，發酵工藝簡單，條件溫和；重組酶能表達分泌至發酵液中，活性高，木糖醇轉化率較高；重組菌株能以玉米芯等天然半纖維素原料為底物，全細胞發酵生產木糖醇，整個工藝過程成本低、能耗少、排污少，具有產業化應用前景。具體實施例方式下面結合實施例，對本專利技術的具體實施方式進一步詳細描述。以下實施例用于說明本專利技術，但不用來限制本專利技術所保護的范圍。在不背離本專利技術精神和實質的情況下，對本專利技術方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本專利技術的范圍。實施例I :重組熱帶假絲酵母工程菌株的構建(I)從土曲霉中克隆出木聚糖酶基因(atn)片段，與Genbank上已經公布的木聚糖酶基因序列作BLAST比對，進行同源性分析，結果顯示，克隆的atn基因為一新基因(Genbank注冊序列號為JQ087496)。(2)從土曲霉中克隆出木糖苷酶基因(atl)片段,與Genbank上已經公布的木糖苷酶基因序列作BLAST比對分析，結果表明，克隆的atl基因序列與Genebank中已報道的A. terreus NIH2624中β -木糖昔酶序列完全一致。(3)利用基因工程手段將木聚糖酶基因(atn)和木糖苷酶基因(atl)串聯在一起，導入pAUR123載體中，構建pAUR-atn-atl質粒,將該質粒導入熱帶假絲酵母中，構建新的菌株，使木聚糖酶和木糖苷酶共表達，具體過程如下將atn基因連接到酵母真核表達載體pAUR123的多克隆位點上，獲得重組質粒pAUR-atn ；根據PADHl和TADHl兩端的堿基序列設計引物，并在引物兩端添加Dra III酶切位點，以pAUR-atn質粒為模板，通過PCR方法擴增atn基因的表達盒P本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種重組熱帶假絲酵母工程菌株C.tropicalis?PNL，其特征在于，將木聚糖酶和木糖苷酶基因表達盒串聯在一起，導入酵母表達載體pAUR123中，構建重組質粒pAUR123?xyn?xyl，將該質粒導入木糖利用型熱帶假絲酵母中。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：李春，郭曉曉，戴大章，
申請(專利權)人：北京理工大學，
類型：發明
國別省市：
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