本發明專利技術是一種表達嗜熱子囊菌光孢變種(Thermoascus?aurantiacus?var.levisporus)熱穩定脂肪酶基因1gh的畢赤酵母工程菌GS-TA-LGH。通過RT-PCR及RACE等方法從嗜熱子囊菌光孢變種中獲得脂肪酶基因1gh，構建表達載體pPIC9K/1gh，并導入畢赤酵母GS115，從中篩選出一種表達脂肪酶的酵母工程菌GS-TA-LGH。該工程菌脂肪酶的酶活性可達19.92U/mg，酶在50℃保溫60min，不損失活性，在60℃保溫60min，仍有66％的活性。具有較高的熱穩定性，作為熱穩定脂肪酶的生產菌株，具有經濟價值和社會價值。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物工程，具體地說是一種表達嗜熱子囊菌光孢變種Thermoascu aurantiacus var. Ievisporus熱穩定脂肪酶基因Igh的畢赤酵母工程菌株 Pichiapastoris GS-TA-LGH。
技術介紹
脂肪酶(lipase)全稱三酰甘油?；饷?，屬于α/β折疊酶家族。它能夠分解生物產生的各種天然油和脂肪，在生物體內參與胞內脂的代謝等重要生命活動。脂肪酶的應用涉及洗滌劑、食品、油脂、皮革、醫藥等工業，近些年來又被研究用于制備化學方法難以得到的手性化合物，以及用于生產作為綠色可再生能源的生物柴油，使得它再度成為生物及化工工業的研究熱點。因為微生物脂肪酶種類多、周期短，耐受性好且易于工業生產，所以在酶理論研究和工業應用中有著更重要的作用。嗜熱子囊菌光抱變種(Thermoascusaurantiacus var. blevisporus)在以撤攬油為誘導源的培養基中50°C條件下可以產生熱穩定的脂肪酶，但要使之用于規?；I生產，還存在一些尚未解決的問題。如嗜熱子囊菌光孢變種培養條件比較苛刻，高溫發酵需要特殊設備，產酶效率低，造成成本增加，因此限制了它的應用。解決這一問題的有效途徑是應用分子生物學手段，將嗜熱子囊菌光孢變種熱穩定脂肪酶基因導入常溫酵母中高效表達，利用酵母生長快、易于培養等特點，使熱穩定脂肪酶基因在常溫和短時間內快速、大量表達，期望達到降低能耗和提高經濟效益的目的。
技術實現思路
本專利技術以嗜熱子囊菌光抱變種(Thermoascusaurantiacus var. levisporus)為材料獲得一種脂肪酶基因，命名為lgh，全長cDNA為1009bp，包含一個由894個核苷酸構成的開放閱讀框，編碼297個氨基酸。將此氨基酸序列在國際基因庫中進行檢索，發現該脂肪酶屬于脂肪酶第3家族。構建重組表達質粒載體pPIC9K/lgh,利用電轉儀進行電擊轉化Pichia pastoris GSl 15，在MD和麗培養基上篩選，經PCR鑒定篩選陽性轉化子，G418篩選多拷貝轉化子，然后進行甲醇誘導表達，獲得畢赤酵母工程菌株GS-TA-LGH。該工程菌株接種于含BMGY培養基中，在28°C 200rpm/min搖床培養6d后，脂肪酶活達到19. 92U/mg, SDS-PAGE檢測該蛋白的分子量為58kDa，酶在50°C保溫60min，不損失活性，在60°C保溫60min，仍有66%的活性。具有較高的熱穩定性，有重要的經濟價值和社會價值。附圖說明圖I脂肪酶基因IghPCR產物電泳圖譜泳道M Marker-DL2000泳道2 :cDNA(0RF)圖2脂肪酶LGH的SDS-PAGE分析泳道M:低分子量蛋白Marker泳道1-7 :酵母工程菌Pichiapastoris GS-TA-LGH的誘導1-7天的表達情況圖3重組脂肪酶LGH的純化泳道M :低分子量蛋白標準泳道I :純化的重組脂肪酶LGH具體實施方式實施例I :嗜熱子囊菌光孢變種(T. aurantiacus var. levisporus)的分離鑒定(I)標本采集從堆肥中采集。(2)分離培養將采集標本取O. 5克放置在PDA平板上50°C培養3天后，進行分離純化。操作步驟參考Cooney and Emerson (1964)文獻。(3)鑒定參考 Cooney and Emerson (1964)和 LaTouche (1950)文獻。實施例2 :脂肪酶基因Igh的克隆(I)嗜熱子囊菌光孢變種總RNA的提取參照Trizol試劑盒說明。(2)cDNA 第一條鏈的合成按照 Takara 公司的 TaKaRa RNA PCR kit (AMV) Ver3. O 試劑盒說明書進行取廣2 μ g總RNA，加RNase Free ddH20至9. 5 μ L，將RNA樣品在75°C 變性5min，立即在冰浴中冷卻5min，然后稍微離心一下，在冰浴中依次加入以下各種成分10mmol/L dNTP Mixture2 μ L，10 X RTBuffer (Mg2+) 2 μ L，25mmol/L MgCl24y L, Oligo d(T)-Adaptor Primerl μ L, RNaseInhibiterO.5 μ L, AMV Reverse Transcriptasel μ L (Final Volume20 μ L),將反應液混合后，室溫下放IOmin,然后42°C溫育60min,再煮沸 5min以滅活反轉錄酶。加入180 μ L DEPC處理的ddH20，稀釋至200 μ L，混勻，稍微離心，保存于-20°C，備用。(3)中間片段的分離根據脂肪酶的同源保守序列設計兼并引物。上游引物為 5’ -CTCTGCYGCMKCBTATTG-3’，下游引物為5’ -CRCTGGTRAYCCAGTACTC-3’(4)3’和5’序列的分離脂肪酶基因5’端序列克隆，使用Tail-PCR的方法，根據中間前面得到片段設計3個向外的特異巢式引物，以及通過巢式引物以及上游公共兼并引物ADh擴增得到。Iip-TAIL-I :5，-GGGGACAGCCGTAGGGGTAGAGAT-3，lip-TAIL-2 :5，-GAGGTCATCCGACACCGAGTTCCAC-3Iip--TAIL-3 :5，-TCGTCTTGGTATCCGCCGCCTC-3’AD15， -NTCGASTWTSGWGTT-3，AD25， -NGTCGASWGANAWGAA-3，AD35’ -WGTGNAGffANCANAGA-3 AD45’ -TGWGNAGSANCASAGA-3’AD55，-AGffGNAGffANCAffAGG-3 脂肪酶基因 3’ 端序列克隆，按照 TaKaRa RNA PCR kit (AMV) Ver3. O (TaKaRa)和 3’ RACE Kit, 2nd Genneration(Roche Applied Science)使用說明進行。3’ RACE 的上游引物序列為5’ -AATCGTGGAACTCGGTGT-3’5， -ACTGTTGGGACACTGGTTCT-3’下游引物為M13M4:5’ -GTTTTCCCAGTCACGAC-3’。(5)基因克隆取O. 5 μ IPCR回收產物與pMD18-T載體進行連接，操作步驟按照 TaKaRa公司產品說明書進行。然后連接產物轉化大腸桿菌DH5 α菌株，在表面涂有X — gal 和IPTG的含氨卞青霉素(100 μ g/mL)的LB平板上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養基中培養過夜。(6)質粒DNA的提取堿法提取質粒DNA。(7)序列測定DNA雙脫氧法測定核苷酸序列，在上海生物工程有限公司進行，序列引物為M13啟動子引物。嗜熱子囊菌光孢變種Igh全長的cDNA為1009bp。開放閱讀框部分為894bp，編碼297個氨基酸的一段序列，將此氨基酸序列在國際基因庫中進行檢索， 發現屬于脂肪酶第3家族。該序列如下(A) SEQ ID NOl 的信息(a)序列特征*長度1009堿基對；*類型核酸；*鏈型雙鏈；*拓撲結構線性(b)分子類型cDNA(C)假設否(d)反義否Ce)最初來源嗜熱子囊菌光孢變種(Th本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種表達嗜熱子囊菌光孢變種(Thermoascus?aurantiacus?var.levisporus)脂肪酶基因lgh的酵母工程菌株，其特征在于該菌為一種畢赤酵母，通過RT?PCR及RACE等方法從嗜熱子囊菌光孢變種（Thermoascusaurantiacus?var.levisporus）獲得熱穩定脂肪酶基因lgh，將該基因克隆到畢赤酵母分泌型表達載體pPIC9K,獲得表達重組質粒pPIC9K/lgh，轉化畢赤酵母GS115,從中篩選出表達熱穩定脂肪酶基因lgh的畢赤酵母工程菌株GS?TA?LGH。
【技術特征摘要】
1.一種表達嗜熱子囊菌光抱變種(Thermoascus aurantiacus var. levisporus)脂肪酶基因Igh的酵母工程菌株，其特征在于該菌為一種畢赤酵母，通過RT-PCR及RACE等方法從嗜熱子囊菌光孢變種(Thermoascusauran...
【專利技術屬性】
技術研發人員：李多川，李萌，郭曉紅，黃剛，
申請(專利權)人：山東農業大學，
類型：發明
國別省市：
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