利用褐色嗜熱裂孢菌(Thermobifida?fusca)生產(chǎn)超氧化物歧化酶(SOD)，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明專利技術(shù)采用褐色嗜熱裂孢菌在液態(tài)發(fā)酵條件下生產(chǎn)SOD，為胞外酶。耐熱SOD產(chǎn)量最高可達(dá)2500U/ml，本發(fā)明專利技術(shù)具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
利用褐色嗜熱裂孢菌生產(chǎn)超氧化物歧化酶(SOD)，屬于生物工程
本專利技術(shù)涉及利用菌株Thermobifida fusca保藏號為ATCC 66938，通過液態(tài)發(fā)酵獲得耐高溫S0D。
技術(shù)介紹
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，簡稱SOD)具有良好的防御氧毒性的作用，能夠增強(qiáng)機(jī)體抗輻射損傷的能力。近年來，它已經(jīng)成為治療炎癥、腫瘤和自身免疫疾病的新型抗炎藥物；化妝品和食品行業(yè)中用于防曬、防皮膚衰老和抗炎的添加劑以及用于某些疾病探針的生化試劑。SOD廣泛存在于動物、植物、所有好氧微生物及少數(shù)厭氧微生物體內(nèi)。當(dāng)前，SOD主要從動物血液(如豬血或者牛血)中提取(袁燁.超氧化物歧化酶的制備方法.申請?zhí)枺?2147888.0, 2002-12-19 ;徐文中，閻家麒.超氧化物歧化酶大規(guī)模生產(chǎn)新工藝.申請?zhí)枺?1144922.5，2001-12-24)，產(chǎn)量受到很大限制，且容易受到原料來源、安全性及質(zhì)量不穩(wěn)定等因素的影響。由于動物、植物特別是動物血液來源困難，而微生物可以人工培養(yǎng)，有利于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。根據(jù)目前報道，已經(jīng)可以通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)S0D，但主要為胞內(nèi)酶(刁治民，姚銀霞，張文靜.酵母菌SOD發(fā)酵條件的研宄.青海師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2002，4:48-51 ;楊明琰，郭愛蓮，沈儉，等.高產(chǎn)SOD酵母菌的誘變選育及發(fā)酵條件研宄.食品科學(xué)，2005，26(10): 147-150)，提取工藝較為繁瑣。天然SOD熱穩(wěn)定性較差，在加工和使用過程中容易受熱失活。如何有效地解決SOD在高溫工藝條件下酶活力的穩(wěn)定問題，如何使含SOD的產(chǎn)品在生產(chǎn)工藝流程中不用顧忌高溫是高效利用SOD的關(guān)鍵。利用生物工程生產(chǎn)新一代高穩(wěn)定性、高耐熱性的SOD是當(dāng)前SOD開發(fā)最重要的途徑。本專利技術(shù)采用褐色嗜熱裂孢菌生產(chǎn)S0D，褐色嗜熱裂孢菌是一種耐熱菌，可以產(chǎn)生耐高溫的S0D，采用該菌發(fā)酵生產(chǎn)SOD具有發(fā)酵周期短，發(fā)酵液中SOD活力較高，且能耐高溫，開發(fā)前景廣闊。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
目前能夠產(chǎn)生SOD的菌株比較少，主要為一些酵母，且為胞內(nèi)酶，需要破壁后才能提取分離，操作成本高，不利于大規(guī)模生產(chǎn)制備。本專利技術(shù)的目的是針對當(dāng)前問題，利用菌株Thermobifida fusca保藏號為ATCC 66938，通過液態(tài)發(fā)酵獲得胞外耐熱S0D。本專利技術(shù)的技術(shù)方案如下:液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組成是碳源0.5-100g/l，氮源0.5-100g/l, K2HP04l-4g/l, MgS047H200.1-0.5g/l，NaCl l_2g/l。在一定體積的發(fā)酵罐內(nèi)裝入發(fā)酵體積60-70% (v/v)的培養(yǎng)基，滅菌冷卻后接入褐色嗜熱裂孢菌，接種量為1-10%，起始PH和發(fā)酵過程pH均為自然，發(fā)酵溫度為20-45?，發(fā)酵周期為2-6天。最終發(fā)酵液中SOD活力最高可達(dá)2500U/ml。本專利技術(shù)所有種子培養(yǎng)基配方與發(fā)酵培養(yǎng)基相同。將斜面菌種接種到裝有種子培養(yǎng)基的三角瓶后，種子的培養(yǎng)時間為48小時，種子的培養(yǎng)溫度為45°C。菌種保存用斜面培養(yǎng)基配方為:葡萄糖20g/l，MgS047H200.2g/l，酵母膏g/1，瓊脂20g/l，pH 自然。SOD活的測定方法是基于SOD抑制氮藍(lán)四唑(NBT)在光下的還原作用。SOD活力測定方法和 SOD 活力定義詳見:Chin_Wen Lin, Jeng-Huh Yang and Lieh-Chi Su, Theextract1n and properties of superoxide dismutase from porcine blood Chin-ffenLin, Jeng-Huh Yang and Lieh-Chi Su，Meat Science，1997，46(3):303-312.本專利技術(shù)有如下特征:(I)褐色嗜熱裂孢菌用于SOD發(fā)酵的碳源可以是葡萄糖、果糖、麥芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖。氮源可以是(NH4)2S04、NH4C1、NH4N03、NaN03、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、尿素、玉米漿、黃豆餅粉。(2)褐色嗜熱裂孢菌發(fā)酵SOD采用的發(fā)酵罐體積為5-50L。攪拌轉(zhuǎn)速為70-150r/min，通風(fēng)量1:0.1-1:0.5v/v/m。結(jié)合本領(lǐng)域的基本常識可根據(jù)生產(chǎn)情況調(diào)整發(fā)酵罐大小。本專利技術(shù)的有益效果:首次采用褐色嗜熱裂孢菌進(jìn)行了 SOD的發(fā)酵，不僅酶活高，而且生產(chǎn)的SOD具有良好的耐熱效果，該方法適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)耐熱S0D，不僅解決當(dāng)前SOD不耐熱的缺點(diǎn)，而且提供了大量的SOD來源?！揪唧w實(shí)施方式】實(shí)施例1將斜面菌種接種到裝有50ml培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，培養(yǎng)基組成為:葡萄糖20g/l，牛肉膏 10g/l，蛋白胨 10g/l，NH4NO31g/!，玉米漿粉 12g/l，pH 自然。45°C，發(fā)酵 72小時。發(fā)酵結(jié)束后，將50ml發(fā)酵液10000轉(zhuǎn)/min離心，去除菌體。上清粗酶液用于測定酶的PH及溫度參數(shù)。取上清粗酶液0.5ml，分別置于pH 4，5，6，7，8的檸檬酸一磷酸緩沖液3.5ml 中，在 45 °C 下測定 SOD 活力分別為 2200，2300，2500，2300，2200U/mL。因此該 SOD 的最適反應(yīng)pH是6。分別取上清粗酶液0.5ml，與3.5ml pH 6的檸檬酸一磷酸鹽緩沖液混合，在 25，35，45，55，65°C 下分別測得酶活為 2100，2300，2500，2000，1900U/mL，因此該酶的最適溫度為45°C。分別取上清粗酶液0.5ml，與3.5ml pH 6的檸檬酸一磷酸鹽緩沖液混合，在25，35，45，55，65，75°C下保溫48小時，然后測定酶活分別為2500，2500，2500，2500，2300，2200U/ml，結(jié)果表明該酶具有良好的耐熱性。不同pH的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液的配制方法參見:諸葛健，工業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊，中國輕工業(yè)出版社，1994。實(shí)施例2將斜面菌種接種到裝有50ml的種子培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，種子培養(yǎng)基組成為:葡萄糖20g/l，牛肉膏10g/l，蛋白胨10g/l，NH4NO31g/!，玉米漿粉12g/l，pH自然，121滅菌20min，搖床轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/分鐘，45°C下培養(yǎng)48小時。該過程有10個相同的三角瓶，共得到500ml種子液。將500ml種子液接種入50L發(fā)酵罐，發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:葡萄糖20g/l，牛肉膏10g/l，蛋白胨3g/l，NH4NO31g/!，玉米漿粉6g/l，pH自然，發(fā)酵溫度為45°C，裝液量70%，通風(fēng)量為1: 1.5v/v/mo發(fā)酵時間為3天。在該條件下，發(fā)酵液中最終SOD活力為2450U/ml。實(shí)施例3將培養(yǎng)好的IL種子液接種到10L發(fā)酵罐中。種子及發(fā)酵培養(yǎng)基組成均為:果糖30g/l，牛肉膏 10g/l，玉米漿粉 20g/l，K2HP044g/l，MgS047H20.5g/l，pH 自然。發(fā)酵溫度為20°C，裝液量70%，通風(fēng)量為1:0.3v/v/m,發(fā)酵時間為5天，在該條件下，發(fā)酵液中最終SOD活力為2500U/mlo實(shí)施例4將培養(yǎng)好的2L種子液接種到20L發(fā)酵罐中。種子及發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:乳糖20g/l，NH4NO31g/!，蛋白胨10g/l，pH自然。接種量為10本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
本專利技術(shù)利用褐色嗜熱裂孢菌(Thermobifida?fusca)通過液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)耐熱的超氧化物歧化酶(SOD)。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：丁彥蕊，牟兆琳，王雪芹，饒榕，
申請(專利權(quán))人：江南大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：江蘇;32
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