一種肝素鈉平衡提取方法技術

本發明專利技術公開了一種肝素鈉提取的方法，其特點在于解決了傳統酶解工藝中腸粘膜酶解不充分，吸附效果不佳的問題。傳統酶解工藝中會產生酶解不均勻現象，本發明專利技術通過在不同的酶解階段引入不同的超聲波對其進行充分酶解使得酶解液肝素鈉含量提高，充分釋放了肝素鈉。在吸附階段，本發明專利技術通過過濾凈化了吸附母液水質，使得吸附環境更清潔，樹脂更易吸附，少被污染和堵塞，從而提高了肝素鈉生產效率。本發明專利技術通過以上兩步驟使得肝素鈉收率提高10％-20％，具有顯著經濟效益。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術方法涉及的是一種以豬小腸粘膜為材料的提取肝素鈉技術，方法通過超聲波生物酶解技術、層析技術提高了現有技術水平，從而提高了肝素鈉產量的一種提取方法。
技術介紹
心腦血管疾病是人類的頭號疾病殺手。隨著人們生活水平提高帶來的營養過剩、全球環境的惡化、生活節奏加快、人口老齡化加劇，致使全球心腦血管疾病的發病率和死亡率正逐年增高，肝素的出現為眾多心腦血管疾病患者創造了生命的奇跡。目前肝素是世界上最有效和臨床用量最大的抗凝血藥物，主要應用于心腦血管疾病和血液透析治療，其中，其在血液透析治療中是唯一有效的特效藥物。臨床應用及研究顯示，肝素除具有抗凝血作用外，還具有其他多種生物活性和臨床用途，包括降血脂作用、抗中膜平滑肌細胞(SMC)增 生、促進纖維蛋白溶解等作用。此外，低分子肝素是由肝素原料藥作為原料進一步加工成的一大類抗血栓的藥物，具有更為廣泛的臨床醫學用途，成為治療急性靜脈血栓和急性冠脈綜合癥(心絞痛、心肌梗塞)等疾病的首選藥物。肝素是世界上迄今為止已知的分子結構最復雜的化合物，短期內無法人工化學合成，目前只有來源于豬小腸粘膜的肝素能夠用于臨床治療。肝素原料藥的原料是肝素粗品，其提取只能源自健康生豬的小腸粘膜，由于含有大量雜質蛋白、雜質核酸、微生物等雜質，需經過物理和化學提取分離過程，定向獲取天然結構基團完整的肝素，從而制成肝素原料藥。肝素鈉原料藥是標準肝素制劑的唯一有效成分和低分子肝素原料的生產起點，目前肝素制劑只有按照注射給藥方式用于臨床，這使得肝素原料藥需要有很高的純度，方可保證制劑的用藥安全。有報道稱采用超聲波輔助酶解和鹽解過程可提高收率，如“黑龍江八一農墾大學，宋大魏畢業論文，《肝素的高效提取和分離純化技術研究》，通過研究發現，超聲波通過高壓強空化效應確實可以幫助細胞破裂，釋放更多的肝素，但在單頻和雙頻下還不能完全適應肝素鈉酶解過程，通過研究發現被分解物質的分子量大小與頻率的關系密切，酶解肝素鈉的過程又需要不同的頻率完成，比如28KHz、40KHz、68KHz之所以要采用這樣的順序，是因為酶解過程是一個由大到微小的過程，28KHz是將大組織分解成小結構的液態組織在這個時候會釋放10%肝素鈉，40KHz是將液態組織分解成細小的水解液這樣會釋放60%肝素鈉，68KHz是將細小水解液分解成微小水解液這會釋放30%肝素鈉。三個步驟加載一起基本可以完整表達超聲波酶解肝素鈉過程。所以本專利技術提供的是一種適宜于完整酶解過程所需要的多種頻率的超聲波結合在一起的方法，并且適用于大規模生產，產業化效果顯著。研究傳統方法發現，采用樹脂吸附方式提取肝素鈉的方法都存在一個問題，樹脂投入吸附罐后，并不是所有樹脂都得到了充分利用，在樹脂攪拌吸附時，酶解液在罐內形成旋渦，底部樹脂密度大于上部，恰恰底部肝素濃度低，上部濃度高，且底部有雜質沉淀，另外漂浮在吸附罐內上部樹脂易被酶解液中的油脂成分堵塞，堵塞后的樹脂吸附能力大大下降，這些問題影響了樹脂吸附，本專利技術是針對上述問題采用層析方法解決這一難題，目前未發現在肝素鈉粗品生產中采用層析方法的相關報道。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種利用超聲波正確的頻率對整個酶解過程提高肝素鈉收率的方法，其成本低、收率高、能耗低、污染小。本專利技術采用如下技術方案，其特征包括如下步驟A采用常規酶解法在酶解罐中混合豬小腸粘膜、鹽、堿、蛋白酶和水；B對混合后的液體分別加入三種頻率的超聲波進行酶解，其頻率分別為28KHz、40KHz、68KH，工作時間分別為20分鐘、30分鐘、10分鐘，功率分別為500W、400W、500W，制得豬小腸酶解液；C采用常規法加熱酶解液使蛋白酶失活蛋白變性；D采用帶有10 μ m-50 μ m的過濾裝置過濾雜質并采用帶有恒溫循環裝置的層析設備進行吸附；E采用常規法洗脫樹脂；F采用常規法沉淀肝素鈉；6采用常規法純化肝素鈉；H最后采用常規法干燥得到肝素鈉。本專利技術具有以下優點 1.工藝簡單，操作簡便，投資少，對現有設備改變不大，適合大規模工業化生產。2.肝素鈉收率提高，質量穩定。以本方法生產的肝素鈉純度可達105_120IU/mg，肝素鈉收率可達I億IU/1500-1700根重量在1200克-1400克豬小腸粘膜，較現有技術提高 20-30%。3.減少污染，降低成本。本專利技術方法可以杜絕在吸附罐的樹脂在洗脫時流入排水系統進而對水源造成長期污染。4.降低能耗，減少生產成本。本專利技術方法采用循環水系統，較傳統工藝節電力30%。具體實施例方式實施例1，包括以下步驟A混合酶解液采用傳統酶水解工藝，用健康豬小腸粘膜為原料，加入水、蛋白酶、腸衣鹽、氫氧化鈉，其比例分別為(本專利按份來計算)，取100份腸粘膜加加500L水500克蛋白酶3000克腸衣鹽，一起投入反應罐中，攪拌均勻后，用2mol濃度氫氧化鈉調節酶解液 PH 至 8. 0-9.0。B超聲波工作過程在酶解液中溫度達到40度時分別加入28ΚΗζ、40ΚΗζ、68ΚΗζ超聲波發生器，設定其工作時間分別為20分鐘、30分鐘、10分鐘，功率分別為5000W、4000W、5000W。超聲波結束后開始升溫至55-60°C，恒溫攪拌酶解2H。C蛋白酶失活過程將酶解液快速加溫至85-90°C，保溫10-30分鐘，開始過濾。D過濾吸附待蛋白酶失活過程結束，開始過濾，先用100-120目濾網過濾雜質，收集濾液。濾液，再用 ο μ m-50 μ m的過濾裝置過濾，過濾后的液體變清澈，將酶解液降溫后，通過自循環裝置，把酶解液循環通過預裝好樹脂的層析柱，循環為封閉式循環，隔絕了與空氣的接觸，柱高為樹脂高度的3倍，循環8H，同時保持溫度60°C，壓力表顯示1. OlMPa，流速表顯不3m3/H。E洗脫將吸附后的樹脂用15% -19%氯化鈉溶液(樹脂量的I倍)攪拌洗脫2_4H2次，收集洗脫液，然后再用20%氯化鈉溶液(樹脂量的I倍)洗脫I次，收集洗脫液。F肝素鈉沉淀將步驟E中洗脫液合并，加入85% -95%乙醇攪拌，直到沉淀液乙醇濃度達到45-50度，停止攪拌，靜置12H，將上部酒精回收待下次使用，收集下部肝素鈉沉淀物。G肝素鈉純化將步驟F所得肝素鈉沉淀用3 %氯化鈉溶液溶解，用200-300目濾網過濾，除去雜質，在加入85% -95 %乙醇攪拌，直到溶液濃度達到45% -50%，靜置沉淀8H，回收上部酒精，收集下部肝素鈉沉淀，然后加入85 % -95 %乙醇脫水，收集肝素鈉沉淀。H烘干將收集的肝素鈉沉淀至于鼓風干燥箱中風干，至半干時，加入蒙脫石干燥，可得肝素鈉。實施例2本實施例的步驟同實施例1只是在吸附層析柱的流速和壓力上作了改變，實施例2改為壓力表顯示1. 02MPa，流速表顯示5m3/H。 實施例3本實施例的步驟同實施例1只是在吸附層析柱的流速和壓力上作了改變，實施例3改為壓力表顯示1. 025MPa，流速表顯示10m3/H。本專利技術可用其它不違背本專利技術精神或主要特征的具體形式來概述，在不脫離本專利技術上述主題范圍的情況下，根據本領域普通技術知識和慣用手段做出來的各種變更和替換，均落入本專利技術保護范圍。權利要求1.，具體步驟如下 A采用常規酶解法在酶解罐中混合豬小腸粘膜、鹽、堿、蛋白酶和水；B對混合后的液體分別加入三種頻率的超聲波進行酶解，其頻率分別為28KH本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種肝素鈉平衡提取方法，具體步驟如下：A采用常規酶解法在酶解罐中混合豬小腸粘膜、鹽、堿、蛋白酶和水；B對混合后的液體分別加入三種頻率的超聲波進行酶解，其頻率分別為28KHz、40KHz、68KH，工作時間分別為20分鐘、30分鐘、10分鐘，制得豬小腸酶解液；C采用常規法加熱酶解液使蛋白酶失活蛋白變性；D采用帶有10μm?50μm的過濾裝置過濾雜質并采用帶有恒溫循環裝置的層析設備進行吸附；E采用常規法洗脫樹脂；F采用常規法沉淀肝素鈉；G采用常規法純化肝素鈉；H最后采用常規法干燥得到肝素鈉。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：譚科，
申請(專利權)人：譚科，
類型：發明
國別省市：