本發明專利技術公開了一種蠅蛆甲殼素、殼聚糖的制備工藝及蠅蛆甲殼素在誘導深綠木霉T2菌株產生幾丁質酶中的應用，屬于生物技術領域。其中蠅蛆甲殼素的制備工藝主要是將傳統的鹽酸除鈣工藝改為EDTA除鈣，減少了廢酸排放的環境污染，避免了濃酸對甲殼素分子鏈的破壞，獲得了高品質的甲殼素產品；在蠅蛆殼聚糖的制備工藝中，將高溫濃堿回流4h的傳統工藝改為氫氧化鈉-戊醇反應體系，并采用微波加熱處理兩次，提高了堿液利用率，極大的縮短了反應時間，節約了能源消耗，獲得了含水量低，脫乙酰度較高的白色粉末狀殼聚糖產品。本發明專利技術的蠅蛆甲殼素還可以作為碳源，誘導深綠木霉T2菌株產生幾丁質酶，其誘導效果顯著。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物
，具體地，一種蠅蛆甲殼素、殼聚糖的制備工藝及其在誘導深綠木酶T2菌株產生幾丁質酶中的應用。
技術介紹
甲殼素(Chitin)又名幾丁質、甲殼質、殼多糖、聚乙酰氨基葡萄糖等，化學名為1， 4-2-乙酰氨基-2-脫氧-β-D-葡聚糖，是N-乙酰基-D-葡萄糖胺(GlcNAc)以β_1，4鍵結合而成的直鏈多聚物(C16H2601(lN2)n。廣泛存在于甲殼綱動物蝦、蟹的甲殼、昆蟲的甲殼、真菌(酵母，霉菌)、藻類及植物的細胞壁中。殼聚糖(Chitosan)則是甲殼素脫去C2乙酰基的產物，又名甲殼胺、脫乙酰甲殼素、可溶性甲殼素、聚葡萄糖胺等，化學名為聚(1，4)-2-氨基_2_脫氧-B-D-匍萄糖。目前國內甲殼素和殼聚糖的生產主要集中在沿海城市，大多以蝦、蟹殼為原料，以蠅蛆為原料獲取甲殼素和殼聚糖 的甚少。由于來源不同，蠅蛆甲殼素和殼聚糖的獲取在工藝條件上與蝦、蟹殼同類物質的獲取是有差異的，而目前提取蠅蛆甲殼素和殼聚糖所用方法幾乎是完全的套用以蝦、蟹殼為原料的提取工藝。這種以濃酸濃堿制備甲殼素和殼聚糖的方法，不僅成本高、能耗大、產品品質差，而且會造成嚴重的環境污染。木霉菌(Trichoderma spp.)是最有開發利用潛力因而最受關注的一類植物病害生物防治微生物，產生幾丁質酶是其主要生防作用機制之一。木霉分泌產生的一系列細胞壁降解酶，如葡聚糖酶、幾丁質酶、纖維素酶、蛋白酶等起著重要的作用，其中以幾丁質酶尤為重要。目前以對哈茨木霉幾丁質酶研究最為深入。據報道木霉幾丁質酶在非誘導條件下表達量很少，而在誘導條件下大量產生，其中內切幾丁質酶產生較多，并表現出極高的抑菌活性。關于不同營養條件對哈茨木霉、哈茨木霉TM菌株、哈茨木霉PI菌株幾丁質酶產生的誘導效果國內外已有報道，而且誘導產生的幾丁質酶粗提物對多種病原真菌均有顯著的拮抗活性。有關利用蠅蛆甲殼素(幾丁質)和蠅蛆殼聚糖(脫乙酰幾丁質多糖)對深綠木霉 T2菌株產生幾丁質酶影響的研究尚未見報道。
技術實現思路
本專利技術的目的是提出一種蠅蛆甲殼素、殼聚糖的制備工藝，解決了以濃酸濃堿制備甲殼素和殼聚糖的傳統工藝中存在的成本高、能耗大、產品品質差，而且會造成嚴重的環境污染的缺點。本專利技術的另一個目的是提出一種蠅蛆甲殼素在誘導深綠木酶T2菌株產生幾丁質酶中的應用。實現上述目的的技術方案如下一種蠅蛆甲殼素的制備工藝，以蠅蛆為原料制成粉體，經除鈣、除蛋白質、氧化及還原處理后制得甲殼素，所述除鈣過程采用EDTA除鈣法。進一步地，蠅蛆甲殼素的制備工藝，具體包括如下步驟 (1)原料預處理 將干蠅蛆粉碎,用水沖洗,洗去大量的蛋白質成分,將剩余蛆皮過濾收集備用；(2)EDTA 除鈣 稱取步驟(I)制得的清潔、干燥的蠅蛆蛆皮，用飽和EDTA溶液浸泡20 30h，除去鈣質,后過濾除去EDTA，并將蛆皮用水洗至中性； (3)稀喊除蛋白質 將步驟(2)處理過的蛆皮再用8 12% NaOH水溶液，沸水浴1. 5 3h，以水解蛋白質，加熱期間不斷攪拌，且期間至少更換4次堿液，加熱結束，除去堿液，水洗至中性，得到甲殼素粗品； (4)精制制得成品 將步驟(3)制得的甲殼素粗品，用O. 3 O. 8% KMnO4水溶液浸潰氧化20 60min，水洗除盡KMnO4后，再用O. 5 1. 5%草酸水溶液于60 70°C下，攪拌進行脫色反應待產物變白為止，將產物水洗至中性，陰干，得白色片狀甲殼素。采用上述制備工藝制得的蠅蛆甲殼素為原料來制備殼聚糖，其制備工藝包括如下步驟 (1)脫乙酰反應 將精制的蠅蛆甲殼素與35 45%的NaOH-戊醇溶液混合均勻，置于700 900W微波爐中，以95%功率的微波條件進行脫乙酰反應，處理2次，每次2 3min，中途過濾更換NaOH-戊醇混合液一次； (2)稀酸溶解 步驟(I)的反應結束后，用熱水洗滌產物至中性，再用甲醇浸泡洗滌后，將濕品溶于4 6%醋酸溶液中，過濾除去不溶物； (3)制得成品 將步驟(2)制得的產物再用8 12%的NaOH溶液中和，析出膠體物，離心洗滌至中性，真空干燥，研細，得到白色殼聚糖粉末。本專利技術還提供了蠅蛆甲殼素在誘導深綠木酶T2菌株產生幾丁質酶中的應用，以蠅蛆甲殼素為碳源，最佳產酶時間為120h。與現有技術相比，本專利技術具有如下有益效果 (I)在蠅蛆甲殼素的制備工藝中，將傳統的鹽酸除鈣工藝改為EDTA除鈣，減少了廢酸排放的環境污染，避免了濃酸對甲殼素分子鏈的破壞，獲得了高品質的甲殼素產品。(2)在蠅蛆殼聚糖的制備工藝中，將高溫濃堿回流4h的傳統工藝改為氫氧化鈉-戊醇反應體系，并采用微波加熱處理兩次，提高了堿液利用率，極大的縮短了反應時間，節約了能源消耗。獲得了含水量低，脫乙酰度較高的白色粉末狀殼聚糖產品。(3)本專利技術的蠅蛆甲殼素、殼聚糖的優化制備工藝及蠅蛆甲殼素在誘導深綠木霉T2菌株產生幾丁質酶中的應用，可以通過下述試驗得到進一步的說明。I材料方法1.1蠅蛆甲殼素和殼聚糖優化后的制備工藝流程權利要求1.一種利用蠅蛆甲殼素制備殼聚糖的工藝，其中，所述蠅蛆甲殼素的制備是以蠅蛆為原料制成粉體，經EDTA除鈣、除蛋白質、氧化及還原處理后制得甲殼素，具體包括如下步驟(1)原料預處理將干蠅蛆粉碎，用水沖洗，洗去大量的蛋白質成分，將剩余蛆皮過濾收集備用；(2) EDTA除鈣稱取步驟(I)制得的清潔、干燥的蠅蛆蛆皮，用飽和EDTA溶液浸泡 20 30h，除去鈣質，后過濾除去EDTA，并將蛆皮用水洗至中性；(3)稀堿除蛋白質將步驟 (2)處理過的蛆皮再用8 12% NaOH水溶液，沸水浴1. 5 3h，以水解蛋白質，加熱期間不斷攪拌，且期間至少更換4次堿液，加熱結束，除去堿液，水洗至中性，得到甲殼素粗品；(4) 精制制得成品將步驟(3)制得的甲殼素粗品，用O. 3 O. 8% KMnO4水溶液浸潰氧化20 60min,水洗除盡KMnO4后，再用O. 5 1. 5%草酸水溶液于60 70°C下，攪拌進行脫色反應待產物變白為止，將產物水洗至中性，陰干，得白色片狀甲殼素；其特征在于，包括如下步驟(1)脫乙酰反應將精制的蠅蛆甲殼素與35 45%的NaOH-戊醇溶液混合均勻，置于700 900W微波爐中，以95%功率的微波條件進行脫乙酰反應，處理2次，每次2 3min，中途過濾更換 NaOH-戊醇混合液一次；(2)稀酸溶解步驟(I)的反應結束后，用熱水洗滌產物至中性，再用甲醇浸泡洗滌后，將濕品溶于 4 6%醋酸溶液中，過濾除去不溶物；(3)制得成品將步驟(2)制得的產物再用8 12%的NaOH溶液中和，析出膠體物，離心洗滌至中性， 真空干燥，研細，得到白色殼聚糖粉末。全文摘要本專利技術公開了一種蠅蛆甲殼素、殼聚糖的制備工藝及蠅蛆甲殼素在誘導深綠木霉T2菌株產生幾丁質酶中的應用，屬于生物
其中蠅蛆甲殼素的制備工藝主要是將傳統的鹽酸除鈣工藝改為EDTA除鈣，減少了廢酸排放的環境污染，避免了濃酸對甲殼素分子鏈的破壞，獲得了高品質的甲殼素產品；在蠅蛆殼聚糖的制備工藝中，將高溫濃堿回流4h的傳統工藝改為氫氧化鈉-戊醇反應體系，并采用微波加熱處理兩次，提高了堿液利用率，極大的縮短了反應時間，節約了能源消耗，獲得了含水量低，脫乙酰度本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種利用蠅蛆甲殼素制備殼聚糖的工藝，其中，所述蠅蛆甲殼素的制備是以蠅蛆為原料制成粉體，經EDTA除鈣、除蛋白質、氧化及還原處理后制得甲殼素，具體包括如下步驟：（1）原料預處理：將干蠅蛆粉碎，用水沖洗，洗去大量的蛋白質成分，將剩余蛆皮過濾收集備用；（2）EDTA除鈣：稱取步驟（1）制得的清潔、干燥的蠅蛆蛆皮，用飽和EDTA溶液浸泡20～30h，除去鈣質，后過濾除去EDTA，并將蛆皮用水洗至中性；（3）稀堿除蛋白質：將步驟（2）處理過的蛆皮再用8～12%?NaOH水溶液，沸水浴1.5～3h，以水解蛋白質，加熱期間不斷攪拌，且期間至少更換4次堿液，加熱結束，除去堿液，水洗至中性，得到甲殼素粗品；（4）精制制得成品：將步驟（3）制得的甲殼素粗品，用0.3～0.8%?KMnO4水溶液浸漬氧化20～60min，水洗除盡KMnO4后，再用0.5～1.5%草酸水溶液于60～70℃下，攪拌進行脫色反應待產物變白為止，將產物水洗至中性，陰干，得白色片狀甲殼素；其特征在于，包括如下步驟：????（1）脫乙酰反應????將精制的蠅蛆甲殼素與35～45%的NaOH?戊醇溶液混合均勻，置于700～900W微波爐中，以95%功率的微波條件進行脫乙酰反應，處理2次，每次2～3min，中途過濾更換NaOH?戊醇混合液一次；????（2）稀酸溶解????步驟(1)的反應結束后，用熱水洗滌產物至中性，再用甲醇浸泡洗滌后，將濕品溶于4～6%醋酸溶液中，過濾除去不溶物；????（3）制得成品????將步驟（2）制得的產物再用8～12%的NaOH溶液中和，析出膠體物，離心洗滌至中性，真空干燥，研細，得到白色殼聚糖粉末。...
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：梁巧蘭，徐秉良，師桂英，魏列新，薛應鈺，楊順義，宋文勇，
申請(專利權)人：甘肅農業大學，
類型：發明
國別省市：
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