一種芽孢桿菌及其菌劑和制備方法與應用技術

本發明專利技術公開了一種芽孢桿菌，所述的芽孢桿菌為解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）WY11，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC），保藏日：2012年10月11日，保藏編號：CGMCC?No.6663；所述芽孢桿菌為活性成分的菌劑，是以所述解淀粉芽孢桿菌經斜面培養、種子培養、發酵并添加活性劑后制成的菌劑；所述芽孢桿菌為活性成分的菌劑的制備方法，包括斜面培養、種子培養、發酵、液體菌劑制備、固體菌劑制備步驟；所述芽孢桿菌為活性成分的菌劑在制備毒殺植物根結線蟲藥物中的應用。本發明專利技術所述解淀粉芽孢桿菌和菌劑對植物根結線蟲均有顯著的毒殺作用，使用方便，對人畜無毒害作用，同時還能調節植物微生物生態區系，促進植物生長。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于微生物
，具體涉及一種芽孢桿菌及其菌劑和制備方法與應用。
技術介紹
植物寄生線蟲是植物的主要病原物之一，每年造成約1000億美元的損失。其在全世界廣泛分布，寄主范圍廣泛，它能使細菌和真菌更易于侵染植物，是誘發植物病害的重要原因之一。煙草根結線蟲是兩種嚴重危害煙草的病害，隨著煙草生產的發展，連作面積的增加，危害日趨嚴重，線蟲病害是許多國家煙草生產的主要限制因素之一，在我國各大煙區造成了嚴重危害，僅根結線蟲病在云南省的年發病面積達2 3萬公頃，病株造成煙葉減 產30%-50%。煙草線蟲病害的防治目前多采用化學防治、輪作及抗病品種，但效果均不太理想，且存在諸多弊端。如目前使用的化學殺線蟲劑多為劇毒或高毒、高殘留農藥，對土壤微生物、植物、水源和大氣層帶來嚴重污染或破壞，同時線蟲抗藥性問題也日益突出，而且藥物在植物體內殘留會間接對人類造成危害。因此急需開發對環境友好，對人畜無毒的防治線蟲病害的微生物制劑。植物寄生線蟲生防細菌的研究是利用植株上附生的拮抗細菌來防治植物病蟲害的有效途徑，也是最近幾年興起的新的研究熱點，而篩選高效和活性穩定的拮抗菌株則是保證生物防治獲得成功的先決條件。目前主要研究的生防細菌有植物根圍促生細菌(PGPR)、穿刺巴氏桿菌 iPas teuria pene trans )、假單胞桿菌 iPseudomonas spp.)、蘇云金芽孢桿菌{Bacillus thuringiensis)0這些植物內生細菌能夠定殖在植物組織間，生存環境穩定，不易受到外界環境的影響，且對人畜無毒害，對環境友好，是重要的植物病害生防細菌資源。但是據可查資料，源于植物內生的解淀粉芽孢桿菌及其制劑的制備和利用該制劑對植物根結線蟲進行防治的研究一直未見報道。
技術實現思路
本專利技術第一目的在于提供一種芽孢桿菌，第二目的在于提供一種以所述芽孢桿菌作為活性成分的菌劑，第三目的在于提供所述以芽孢桿菌作為活性成分的菌劑制備方法，第四目的在于提供所述菌劑在制備毒殺植物根結線蟲藥物中的應用。本專利技術第一目的是這樣實現的，所述的芽孢桿菌為解淀粉芽孢桿菌OfeciJAz1Samyloliquefaciens ) WY11,保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏日2012年10月11日，保藏編號CGMCC No. 6663。所述解淀粉芽孢桿菌屬于真細菌界，后壁菌門，桿菌綱，芽孢桿菌目，芽孢桿菌科，芽孢桿菌屬。—解淀粉芽孢桿菌WYll的獲得與鑒定(I)解淀粉芽孢桿菌WYl I的獲得與鑒定本專利技術所述的解淀粉芽孢桿菌，是從煙草葉片中分離得到。煙草樣品采自云南省玉溪市研和鎮，采集長勢良好無病煙株旺長期葉片，洗凈后隨即稱取葉片0. 4g，在70%酒精中振蕩浸泡lmin，再用有效氯含量1%的次氯酸鈉溶液振蕩浸泡Imin后，用無菌水沖洗4次。消毒后的組織與滅菌鋼珠一并放入2ml滅菌離心管，加入600ul無菌水，用QIAGEN高通量組織研磨器研磨3min，頻率為30r/s。研磨后的母液采用梯度稀釋法稀釋后涂布平板，各單操作分別重復四次，在28°C下黑暗培養48h。挑取單菌落，重新于平板上劃線純化保存，其中長勢旺盛者，定名為WYll菌株。所用培養基配方酵母浸出汁3.0g，牛肉浸膏l.Og，大豆蛋白胨5.0g，NaCl 5. Og,瓊脂 17. Og,蒸餾水 IOOOmL, pH :7. O。對上述分離的菌株WY11，通過生物學特性觀察，進行進一步的形態鑒定，方法如下 觀察菌落的形態、大小、凹凸度、邊緣，革蘭氏染色，生理生化特征測試具體方法參照《常見細菌系統鑒定手冊》。該菌16S rDNA序列擴增引物采用F27/R1492，擴增產物委托上海英駿生物技術有限公司進行序列測定。以上實驗結果記錄如下 A、形態特征菌體形狀為桿狀，菌體平均大小為0. 5^1. 5umXl. 6^2. 5um，革蘭氏染色為陽性。內生芽孢，無鞭毛。B、培養特征在NA培養基上菌落呈白色，褶皺凸起，邊緣不整齊。C、生理生化特性好氧生長，葡萄糖發酵陽性，淀粉水解試驗陽性，明膠液化試驗陽性，V. P試驗陽性，接觸酶反應陽性，甲基紅反應陽性，硝酸鹽還原試驗陽性，檸檬酸鹽利用陽性。表I菌株WYll的生理生化特征 生化特征 |WY11菌株D一葡萄糖 ；D一甘露糖 T淀粉水解T酪氨酸水解 ^明膠水解_+_V-P反應十接觸酶T甲基紅T硝酸還原_+_2% NaCl+￥ 酸鹽利用 I+|5%NaCl1~ 注“ + ”表示陽性反應，表示陰性反應。D、菌株的穩定性該菌生長溫度范圍在12 48°C，最適宜生長溫度為28 34°C，生長pH值在6. 5 8，最適宜pH值為7。E、16S rDNA序列分析對該菌株進行16S rDNA序列測定，GenBank注冊號JQ936682. 1，WYll菌株16S rDNA序列與假單胞菌屬的菌株相似性達到99%。通過序列比對和生理生化特性將WYll菌株鑒定為解淀粉芽孢桿菌{Bacillus amyloliquefaciens\本專利技術所述的WYll菌株其16S rDNA序列見GenBank: JQ936682. I。(2)解淀粉芽抱桿菌 CfeciJJw1S amyloli quefaci ens ) WY11 的保藏 通過上述鑒定結果，確認菌株WYll為解淀粉芽孢桿MiBacillus的一個株系,命名為WY11,于2012年10月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱06110，地址為北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編100080)，其保藏編號為CGMCC No. 6663。本專利技術第二目的是這樣實現的，以所述解淀粉芽孢桿mBacillusamyloli quefaci ens ) WYl I經斜面培養、種子培養、發酵并添加活性劑后制成的菌劑。本專利技術第三目的是這樣實現的，包括斜面培養、種子培養、發酵、液體菌劑制備、固體菌劑制備步驟，具體包括 A、斜面培養將解淀粉芽抱桿菌CfeciBy1Samyloli quefaci ens ) WY11接種到斜面培養基上，在溫度為28 30°C下培養48h，得斜面菌種； B、種子培養將斜面菌種接種到液體培養基中，在溫度為28 34°C下培養18 24h，得液體發酵種子； C、發酵將液體發酵種子按培養基體積3 5%的量接種入發酵罐，在28 34°C下培養36 48h，攪拌速度為120 150印111，通氣量5 10%，得到解淀粉芽孢桿菌1￥11發酵液； D、液體菌劑制備在發酵液中添加0.16^0. 6%的活性劑充分混勻，得到目標液體菌劑； E、固體菌劑制備在目標液體菌劑中加入吸附劑吸附經風干至水分含量重量比小于13%得到目標固體菌劑。本專利技術第四目的是這樣實現的，所述菌劑在制備毒殺植物根結線蟲藥物中的應用。除非另有說明外，本專利技術中所采用的百分數均為體積百分數。本專利技術所述解淀粉芽孢桿菌和以所述解淀粉芽孢桿菌為活性成分的制劑可應用于植物根結線蟲的防治，具有以下優點 I、本專利技術所述解淀粉芽孢桿菌iBacillus amyloli quefaci ens ) WYll是一種高效生防細菌，以所述解淀粉芽孢桿菌(AaciVAz1S amyloli本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種芽孢桿菌，其特征在于所述的芽孢桿菌為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus?amyloliquefaciens）WY11，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC），保藏日：2012年10月11日，保藏編號：CGMCC?No.?6663；所述解淀粉芽孢桿菌屬于真細菌界，后壁菌門，桿菌綱，芽孢桿菌目，芽孢桿菌科，芽孢桿菌屬。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：夏振遠，汪安云，吳玉萍，莫笑晗，雷麗萍，
申請(專利權)人：云南省煙草農業科學研究院，
類型：發明
國別省市：